CCK8法检测细胞增殖预实验.pdfVIP

SRT-1720, EX527 一定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较 对293T 细胞和白血病细胞株的不同影响，请重复实验。 实验日期：2015/08/22-2015/08/27 实验项目：CCK8 法检测细胞增殖 实验地点：广西医科大学药基楼14 楼生物靶向中心 实验人员：高宗燕、宁海萍、李登峰 实验目的：检测SRT-1720/EX527 刺激293T 细胞后对细胞增殖的影响 主要试剂：SRT-1720, EX527,CCK8 试剂盒 主要仪器：酶标仪 实验步骤： 一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时） 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞至96 孔板。 2 、设置4 个细胞浓度梯度：0 ，2000 ，4000 ，8000，每组4 个复孔。 3、接种后培养24 小时使细胞贴壁，然后加CCK 试剂培养4 小时后测定OD 值，制作出一条以细胞数量为 横坐标（X 轴），OD 值为纵坐标（Y 轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试 用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK 后的培养时间。） 2 9000 y = 1262.4x - 822.82x + 255.31 2 R = 0.9784 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 图一、标准曲线 二、细胞增殖检测 1、在96 孔板中配置100μL 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24 小时（在37℃，5% CO2 的条件下）。 2 、向培养板加入10μL SRT-1720 （终浓度3um ）, EX527 （终浓度100um）。 3、将培养板在培养箱孵育约24h 4 、每孔加入10μLCCK 溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD 值的读数）。 5、将培养板在培养箱内孵育2 小时。 1 6、用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 1 2 3 4 5 6 图二、3um SRT1720 刺激293T 细胞后的细胞增殖曲线。该曲线呈S 形，符合细胞正常生长情况。 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 -2000 0 1 2 3 4 5 6 图三、100um EX527 刺激293T 细胞后的细胞增殖曲线。该曲线前部分呈S 形，符合细胞正常生长情况，但 在进入对数期之后曲线有下滑，之后进入平台期。 分析： SRT1720 为 SIRT1 特异性活化剂，在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，此次实验中 SRT1720 对正常细胞（293T ）的生长无明显抑制作用。暗示SIRT1 的活化对正常细胞的生长可能无明显影 响。 小剂量EX527 为SIRT1 特异性抑制剂，在前期实验中大剂量EX527 对白血病细胞株的生长表现出抑制作用， 而小剂量EX527 无此效应，此次实验中大剂量EX527 对正常细胞（293T ）的生长可能有轻度抑制作用。但 不能以一次实验结果做出肯定的结论，该实验还需重复。