MTT法检测细胞活性及其应用.pdfVIP

MTT 法检测细胞活性及其应用 一、实验目的 1.掌握MTT 法的基本原理和操作，学会应用MTT 法解决简单的实际问题。 2.巩固动物细胞培养的知识，熟练相关操作。 3.学会酶联免疫检测仪（简称酶标仪）的操作方法。 二、实验原理 1.MTT 法又称MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理 为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结 晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 （DMSO） [三联溶液]能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸 收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞 数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药 物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 2.细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保 存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提 高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞 内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融 化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化 使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 3.从动物机体中取出的相关组织通过胰蛋白酶或胶原蛋白酶可以将其分散 成单个细胞。再放于适宜的培养基中，可以使这些细胞生长繁殖以供实验所需。 该实验对无菌要求极高，以培养出满足实验条件的细胞。 4.酶联免疫检测仪测定的原理是在特定波长下检测被测物的吸光值。酶标仪 实质就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计。 三、实验材料，器材与试剂 材料：Hela 细胞 器材：恒温水浴锅，超净工作台，培养箱（37℃，5%CO ），冰箱（4℃、-20℃、 2 -70℃），液氮冰箱，灭菌锅，烧杯，培养瓶，滴管，酒精灯，镊子，离心机，24 孔培养板，96 孔培养板，摇床，酶标仪，倒置显微镜，移液枪 （带枪头），15mL 离心管,冻存管（1-2mL），红血球计数板，记号笔，0.22 μm 滤膜，铝箔纸。 试剂：二甲基亚砜（分析纯），甘油，10%胎牛血清，胰蛋白酶（0.5%），双抗（青 霉素，链霉素 1 万单位/mL）,磷酸缓冲液（配制见附录 1），MTT （3- （4，5- 二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。）（配制见附录2）， DMEM 培养液(配制见附录3)，无菌水，抗肿瘤药物（具体待定） 1 四、实验步骤 A.Hela 细胞复苏 1.从液氮容器中取出从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不 时摇动令其尽快融化； 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管 并滴加10倍以上DEME 培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm，5min； 4. 弃去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养液重悬细胞，计数，调整细 4 胞密度至1×10 个/mL，部分接种培养瓶，37℃培养箱静置培养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养，此后定期更换培养液，维持细胞正常活 性。 B.MTT 检测复苏细胞的细胞活性 Hela 细胞计数用血细胞计数板的四个角上的方块。 1. 接种培养瓶同时，将其余部分接种于96 孔细胞培养板，7 组，每组5 孔， 每孔100 μL,37℃培养箱静置培养； 2.培养24h 后，向每孔内加入用磷酸缓冲液配制的0.5%MTT （5mg/mL）20uL， 37℃培养箱内培育； 3.4h 后终止培养，将孔内培养液小心吸出。每孔加入 150 μL 二甲基亚砜， 置摇床上低速振荡 10min，使结晶物充分溶解。同时每行第一孔设置为调零孔（培 养基、MTT、二甲基亚砜）。用酶标仪OD570nm 处测量各孔吸光值； C.细胞生长曲线制作 接B.2，B.3 步骤，连续测量7 天，根据测量结果绘制细胞生长曲线。 [横坐标生长时间，纵坐标吸光度值。] D.探究某药物对于细胞活性的影响 1.将之前培养于培养瓶中的细胞用 0.5%胰蛋