标准的-定量Q-PCR仪器的具体使用步骤和操作方法.docx

Q-PCR仪器使用具体步骤 首先将MX3000P电源打开，大约1min,将会听到启动的声音。然 后打开桌面上的“ MX3000P软件”，确定软件界面右下面的联机标 志呈绿色。如果不是绿色而是红色，软件会提示Instrumdht to PC Com muni catio ns have failed , 一| 这时只需稍等片刻，待仪器自检 完成，会自动连接计算机； 在“ Mx3000P软件”的“ New Experiment type ”弹出框中选择需 要的实验类型：通常选择 “SYBRGreen（with dissociation curve）, 点击“ OK键”； 确定“Mx3000P软件”界面上面（Selection命令下）的卤钨灯已 经打开。绿色说明已经打开，黄色说明正在预热，红色说明没有 打开； 最好在仪器与光源预热20min后开始实验； 在“ Plate Setup ”里，对96孔板的各空进行设定。设定 Standard（标准品）、NTC（阴性对照）、Unknown样品）等，并选择 正确的通道（FAM,HEX,ROX,Cy5.对于标准品，设定其模板浓度， 还需要对不同的样品进行编号。或者点击“Import ” ,导入以前使 用的96孔板设定。具体为： 首先选择Welltype中的Unknown然后选择下方的ROXSYBR; 选择 Referenee dye 的 ROX 用Replicate symbol对每个样品进行标记（1,2,3 ，XXX等） 切换至“ Thermol profile setup ”界面，进行PCF循环的设定。 可以改变各项温度、时间、循环数等，或者删除、添加特定步骤 和循环。或者点击“Import ”，导入以前设定的PCA程序。表示 表示在这一步结束时采集荧光信号ND * 代表在这一步的全 过程中都采集荧光信号，一般用作溶解曲线分析。 “Thermol profile setup ”设定结束后，点击软件界面右上方 的“ Run,软件界面右下方会出现运行状态显示框 “ Run Status ” 可以选择“ Turn lamp off at end of run ”，点击“ start ”开始 实验，弹出“保存文件的对话框”，选择后保存，弹出另外一个对 话框，选择第二个（预热之后跑），另外在运行过程中可通过点击 “Add cycles ”来增加扩增的循环数，在 PCR运行结束后软件将 自动关闭卤钨灯。 在PCR运行的过程中可以点击“ RawData plots ” ,观察样品的实 时扩增原始结果。 PCR运行结束后，点击“ Analysis ” ,在点击“ Results ” ,软件将 会自动进行结果分析，也可以点击「 手动进行结果分析。 结果分析： 将Q-PCF结果从电脑中拷出来，在电脑上打开文件； 点击菜单栏的“ File ”命令，选择“ Con vert to New Experime nt type ”子命令，弹出“ Selection new Experiment type ”对话框； 在“Selection newExperiment type ” 对话框中选择 “Comparative Quantitation(Calibrator) 命令，将文件转化成分析结果的模式， 点击OK键； 弹出“ Mx3000P软件”界面，在“ Plate Setup ”界面中“首先选 择Welltype中的Un known然后选择下方的 ROX SY BR选择 Reference dye 的 ROX 将 96孔板中的 Actin 样品选中，然后在 Nomalizing assay 中选 择 SYBR； 然后对相同模板的样品标记相同的字母，对相同引物的样品标记 相同的数字； 最后任意(通常选最左侧的)选择一列，在 Well type 中选择 “Calibrator ” , 然后可以进行所含特异引物的样品的选择，选择 后，点击“ Analysis ”命令，在点击“ Results ”即可 对结果进行 可视化的各项分析 。