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原核表示操作步骤及注意事项 时间：20XX-03-03 14:05:01 起源： 作者： 点击： 1046次 将克隆化基因插入适宜载体后导入大肠杆菌用于表示大量蛋白质方法通常称为原核表示。这种方法在蛋白纯化、定位及功效分析等方面全部有应用。大肠杆菌用于表示重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制；用于细菌培养材料不及哺乳动物细胞系统材料昂贵；有多种多样大肠杆菌菌株及和之匹配具多种特征质粒可供选择。不过，在大肠杆菌中表示蛋白因为缺乏修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表示蛋白生物学活性及构象。 表示载体在基因工程中含有十分关键作用，原核表示载体通常为质粒，经典表示载体应含有以下多个元件： （1）选择标志编码序列；（2）可控转录开启子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制序列。 原核表示通常程序以下： 取得目标基因－准备表示载体－将目标基因插入表示载体中（测序验证）－转化表示宿主菌－诱导靶蛋白表示－表示蛋白分析－扩增、纯化、深入检测 一、试剂准备 1、LB培养基。2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃ 二、操作步骤 （一）取得目标基因 1、经过PCR方法：以含目标基因克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不一样酶切位点），PCR循环取得所需基因片段。2、经过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环取得产物。 （二）构建重组表示载体 1、载体酶切：将表示质粒用限制性内切酶（同引物酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 （三）取得含重组表示质粒表示菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，依据重组载体标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步判定。2、测序验证目标基因插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。不然应筛选更多克隆，反复亚克隆或亚克隆至不一样酶切位点。3、以此重组质粒DNA转化表示宿主菌感受态细胞。 （四）诱导表示 1、挑取含重组质粒菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。2、按1∶50百分比稀释过夜菌，通常将1ml菌加入到含50mlLB培养基300ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600 ≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。3、取部分液体作为未诱导对照组，余下加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为试验组，两组继续37℃震荡培养3hr。4、分别取菌体1ml，离心120XXg×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀，70 三、注意事项 1、选择表示载体时，要依据所表示蛋白最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表示；如为取得天然蛋白，可选择非融合表示。2、融合表示时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构阅读不能发生干扰。 怎样做原核表示（prokaryotic expression） 20XX-03-26 22:54:25 起源： 易生物试验 浏览次数：673 网友评论 0 条 首先来部分大肠杆菌表示基础概念：一个完整表示系统通常包含配套表示载体和表示菌株，假如是特殊诱导表示还包含诱导剂，假如是融合表示还包含纯化系统或Tag检测等等。选择表示系统通常要依据试验目标来考虑，比如表示量高低，目标蛋白活性，表示产物纯化方法等等。关键归结在表示载体选择上。? 关键词： 原核 原核表示 prokaryotic expression 大家合成和生物相关物质是从尿素开始，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体这种有机物。在1960年中国科学家采取化学方法首次成功地合成了含有生物活性蛋白质——胰岛素。伴随内切酶发觉和基因工程技术发展，大家发觉用多种不一样载体在原核、真核系统中进行蛋白表示更为行之有效。而这其中大肠杆菌表示系统发展得最为快速、成熟。原核表示含有操作方便、快捷，需时较短，表示量大，适合工业化生产等优点。即使也有缺乏糖基化和表示后加工等问题，当有了其它多个表示系统后，原核系统仍是我们合成外源蛋白首选。?在网上看到有些人把原核表示技术分成四个等级：首次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手，认为十分有意思。不过依据笔者自己经验和耳闻目睹部分经历告诉我：做表示？那是谋事在人，成事在天。有时候你把克隆做出来了，双酶切判定没问题，测序没问题，可是就是看不到表示带。