《PCR仪器的使用及注意事项》.ppt

PCR原理: PCR（聚合酶链式反应）: 是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术， 它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进?行定量分析? PCR工作过程： PCR仪器 BIO-RAD CFX96 ABI7500 QuantStudio3 line9620 定量标准曲线（Quantitation-Standard Curve)相对定量标准曲线（Quantitation-Relative Standard Curve )定量CT比较法（Quantitation-Comparative Ct ΔΔCt）溶解曲线（Melt Curve )基因分型（Genotyping）定性实验（Presence/Absence) 实验类型: 绝对定量&相对定量： 绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数.相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数. 绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线.相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线.  AB7500绝对定量 1、双击桌面图标 ，或从 Start >All Programs > Applied Biosystems > 7500 Software >7500 V2.0 开启软件。进入主界面后选择 Advanced Setup 。 2. 默认进入 Setup 下的 Experiment Properties 界面 2.1 输入实验名称 （ Experiment Name） 2.2 确认仪器型号 2.3 在实验类型中，选择 Quantitation-Standard Curve2.4 选择试剂种类2.5 确认运行模式 TaqMan探针法（寡核苷酸探针）： 5′ 端 荧光报告基团 与靶基因特异性结合的序列 3′ 端 淬灭基团 完整的探针：检测不到报告荧光 切断的探针：检测到报告荧光    5′-3′外切酶活性将探针酶切降解? 水解探针，使报告基团和淬灭基团分离 淬灭基团 报告基团 3. 进入 Setup 下的 Plate Setup 界面，编辑基因（ Target）及样本（ Sample） 3.1在 界面中设置基因及样品， 添加新的基因，并在Target name编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团； 利用 添加新的样本，并编辑样品名称。 3.2在 界面中进行样品板的排布分配 S :标准曲线数据点， U :未知样本， N :阴性对照 勾选基因 勾选样本名称3.3 设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一般情况下，每个 梯度设置三个副孔），而后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S， 在Quantity中输入拷贝数。按照相同操作，完成标准曲线其他数据点的设 置（建议5个梯度）。 标准曲线:标准品 目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系标准曲线的制备:至少5个点的10倍标准曲线  10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv1v 标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v  不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、 iii、 iv、 v 4. 在 Setup 下的 Run Method