《image j对SDS-PAGE灰度分析定量蛋白浓度》.pptVIP

image j对SDS灰度分析定量蛋白浓度 每个泳道对应的数值为点样体积（ μl ），制备所有样品的时候蛋白溶液和2*loading buffer的体积比均为1:1 SDS图像，可以用相机或光密度扫描仪成像，作为标准样品的蛋白最好和待测蛋白的条带大小一致，用Bradford的方法测得标样的浓度，然后把标样的浓度调成300μg/ml。 注意事项： 一般用SDS灰度分析的方法检测蛋白浓度，其上样量不宜过大，条带太黑容易过曝，导致定量结果不准确，检测结果会小于实际的蛋白浓度。 1、打开image j 把SDS图片拖到红色箭头所指区域。 2、单击image—Type—8-bit转换成灰度图像。 3、单击process—subtract background会出现左图的界面，勾选light background和preview，选择合适的像素值，在此一30.0pixels为例，单击OK。 4、方框工具选择并画出第一条永道，单击analyze—gels—select first lane也可以用快捷键（Ctrl+1） 4、方框工具选择并画出第一条永道。单击analyze—gels—select first lane也可以用快捷键（Ctrl+1），会出现左图界面，点击OK，并在图上画出第一条条带。 5、单击analyze—set measurements出现 下图界面，勾选Area和mean gray value单击OK。 7、选好条带以后按住Ctrl+m出现一个文本，如上图所示；然后把鼠标移到黄色方框的中心，按住鼠标，把方框拖到下一个条带，然后按Ctrl+m，文本中出现第二条带的面积和平均灰度值；以此类推。 8、新建一个Excel，把文本框内的数据复制到表格，计算绝对灰度=255-灰度平均值，同时标出点样体积。理论上，标样的绝对灰度值的比值和点样体积比值是相等的，我们可以选择绝对灰度比值和体积比最接近的一对数据，如红色框内数据。 ?