《NK细胞杀伤活性检测-2013-7-5兼》.ppt

NK细胞杀伤活性检测-2013-7-5兼 目的要求 熟悉乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤活性的检测方法。 【原理】 乳酸脱氢酶 (LDH) 是活细胞胞浆内含酶之一。正常情况下，LDH不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶Ⅰ(NAD+) 变成还原型辅酶Ⅰ(NADH2)。后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐 (PMS) 还原硝基氯化四氮唑蓝(NBT)，形成有色的甲臢类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰。利用读取的A值，经过计算即可得知NK细胞杀伤靶细胞的活性。 实验原理 效应细胞 靶细胞 释放LDH 丙酮酸 乳酸 乳酸脱氢酶(LDH) NAD+ NADH+H+ PMS NBT 甲臢(OD570nm） 吩嗪二甲酯硫酸盐 硝基氯化四氮唑蓝 【试剂】 1. 靶细胞 检测人的NK 细胞活性常用的靶细胞为体 外传代细胞株K562。 2. 效应细胞 从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核 细胞。 3. 1640 培养液 4. LDH 底物溶液（临用前配制） NBT 硝基氯化四氮唑蓝 4mg NAD+I 氧化型辅酶I 10mg PMS 吩嗪二甲酯硫酸盐 1mg 【试剂】 加蒸馏水2ml 溶解，混匀后取上清液1.6ml，加1mol/L 乳酸钠0.4ml，然后加入0.1mol/L pH7.4 PBS 至10ml。 5. 1% NP—40 ： 取1ml NP-40 加去离子水99ml。 6. 1mol/L 柠檬酸终止液 取柠檬酸21g 加去离子水100ml 实验步骤 效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞） 靶细胞的制备 效-靶细胞相互作用 酶促反应 结果判读 取培养24~48hr的靶细胞(K562), 洗涤3次（1000rpm×10min）, 最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml, 备用。 靶细胞的制备： 效应细胞的制备 （分离外周血单个核细胞） 采集静脉血4 ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝 分别吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中， 将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入抗凝血 离心2000rpm×20min 密度梯度离心分离淋巴细胞亚群 用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度 （加入0.2ml完全RPMI-1640 ，混匀，1x 107） 将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次 2000rpm×10 min 用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板， 再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层） 计数PBMC 1.计数4个大方格中（即64个小方格）所有细胞数 2.计数原则：数上不数下，数左不数右。 3.总数除以4，所得数据×104即为1ml液体中的细胞总数 4.每ml健康成人血可分离出1×106～2×106个单个核细胞 计数PBMC举例 数4个大方格细胞数分别为：87，79，91，85 总数为： 87+79+91+85=342 一个大方格的平均数为：342/4=85.5 1ml液体中细胞量为：85.5×104 如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据的2倍。 效-靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔细胞培养板的孔中, 每份标本设2个复孔, 同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml RPMI-1640液) 最大释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml1％NP-40液), 1000r/min, 2min后, 置37℃、5％CO2温箱中孵育2-4h。 A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 实验组 自然释放组 最大释放组 1 2 3 4 5 6 效应细胞（100μl） + + -