PCR实验报告（整理）.doc

PAGE PAGE 1 PCR实验报告 7月19日 高遄 实验目的：了解PCR技术原理，掌握最基础的PCR实验步骤。 实验试剂：模板DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，Taq DNA聚合酶，引物，H2O，石蜡油。 实验原理： PCR全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。 基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。PCR反应时，只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+，DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。 双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板DNA两端的特定序列相结合，产生双链区。 DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。 在后续反应中，无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链，都会在高温下解开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板DNA。 由于在PCR反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。 整个PCR的反应全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA结合（退火）、DNA合成（链的延伸）三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应该是2^n，能进一步满足遗传分析的需要。 试剂作用： 引物：DNA复制的起始点，针对复制DNA片段的两端，有5’引物和3’引物 Taq DNA聚合酶：促进dNTPs与模板结合。 Buffer：Tris-HCl反应缓冲液，Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 Mg2+：对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。 石蜡油：防止PCR加热过程中DNA蒸发。 试剂配置体积： 20μl体系中各试剂配置如下表： 试剂 H2O Buffer Mg2+ dNTPs P（引物） T（模板） E（酶） 体积/μl 9 2 2 4 2 1 0.4 温度和时间： 热启动：94℃，5~10min 变性：94℃，45~60s。 退火：50~65℃，1min。退火温度计算：Tm-（5℃~10℃），Tm（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）。 延伸：72℃，1~1.5min。 步骤（2）~（4）热循环25~30个周期 保温：延伸72℃，10min 产物检测：凝胶电泳。 实验步骤： （1）设计20μl体系各试剂配比： 试剂 H2O Buffer Mg2+ dNTPs P（引物） T（模板） E（酶） 体积/μl 9 2 2 4 2 1 0.4 （2）按照预先设计的20μl体积配置6管试管量，实际加入量如下表 试剂 H2O Buffer Mg2+ dNTPs P（引物） T（模板） E（酶） 6x加入体积/μl 54 12 12 暂不加入 12 暂不加入 2.4 将以上试剂按体积加入EP管中，震荡混匀后离心 （3）完成后分6管加入pcr管中，每管15μl体积，标注1-6号码。 （4）在前1-~4号PCR管中加入模板DNA，在5号管中加入C3H模板作为阳性参照，6号中不加任何模板DNA，作为阴性参照。 （5）在加完模板的6管试剂中各加入20μl石蜡油 （6）将PCR管放入PCR仪，按之前设定的加热温度与时间设置 a．热启动：94℃，2min；80℃，1min； 此时在各管中加入dNTPs 4μl b．变性：94℃，30s； c．退火：65℃，1.5min； d．延伸：72℃，2min 步骤b~d循环40次 e．保温：72℃，10min （7）完成后用3%琼脂糖凝胶（60ml）电泳进行检测。 实验结果： PCR目标产物约为295bp 琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示 1 2 3 4 5 6 Marker 1、2号泳道为♂性小鼠DNA模板的PCR产物 3、4号泳道为♀性小鼠DNA模板的PCR产物 5号泳道为C3H阳性参照 6号泳道为阴性参照 由Marker参照可知，PCR产物大小约为290~300bp