常用免疫学检验关键技术的基本原理.doc

常见免疫学检验技术基础原理 免疫学检测即是依据抗原、抗体反应原理，利用已知抗原检测未知抗体或利用已知抗体检测未知抗原。因为外源性和内源性抗原均可经过不一样抗原递呈路径诱导生物机体免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T细胞克隆扩增，并分泌特异性免疫球蛋白（抗体）。因为抗体－抗原结合含有特异性和专一性特点，这种检测能够定性、定位和定量地检测某一特异蛋白（抗原或抗体）。免疫学检测技术用途很广泛，它们可用于多种疾病诊疗、疗效评价及发病机制研究。 最初免疫检测方法是将抗原或抗体一方或双方在某种介质中进行扩散，经过观察抗原－抗体相遇时产生沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达成诊断目标。这种扩散能够是蛋白自然扩散，比如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验。单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好小孔内，让抗原从小孔向四面凝胶自然扩散，当一定浓度抗原和凝胶中抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心圆形沉淀圈，沉淀圈直径和加入抗原浓度成正比。 利用蛋白在不一样酸碱度下带不一样电荷特征，能够利用人为电场将抗原、抗体扩散，比如免疫电泳试验和双向免疫电泳。免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成份依次分散开。然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对多种抗原混合抗体，让各抗原成份和对应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。然后利用标准抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体）判别。上述方法全部是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生沉淀，所以灵敏度有很大局限。比浊法引入沉淀检测产生免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生浊度，依据标准曲线来计算抗原（或抗体）含量。该方法不仅大大提升了检测灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量检测。 免疫印迹法则首先经过电泳分离标准已知抗原，然后将电泳分离蛋白质转移到硝酸纤维膜上，浸于待测血清中。假如血清中含有和一个或多个抗原相对应抗体话，则在该抗原印迹部位形成免疫复合物沉淀。在洗去未结合抗原和抗体后，在膜上加标识抗人免疫球蛋白抗体，此抗体能够和病毒抗原和人抗体形成免疫复合物发生反应，最终加入显色底物（能够是一般显色剂，化学发光剂或放射性同位素等）进行显色。因为利用了第二种抗体进行了信号放大，而且能够利用高灵敏显色方法，灵敏度也得到了很大提升。现在该方法已经利用凝集反应检测抗原－抗体反应也是较传统手段之一。利用带有抗原乳胶颗粒等不溶性颗粒抗原和对应抗体结合形成凝集团块，经过凝集现象，就能够达成检测目标。不管是直接凝集法还是间接凝集法全部可对抗原或抗体进行检测。还能够利用二抗对信号进行放大，从而提升检测灵敏度。 利用补体介导反应（比如溶血反应），检测抗原－抗体反应也是过去常用方法。抗体和细胞表面抗原相遇，形成红细胞-抗体复合物即可使加入反应中补体活化，造成细胞溶解，此方法可用于红细胞多种抗原或对应抗体检测，另外利用补体反应竞争效应，也可对抗原－抗体反应进行定量检测利用带有标识（荧光素、同位素、胶体金或酶）抗体（抗原）检测抗原－抗体反应是现在应用最广泛、最灵敏方法，使用放射性同位素标识法可使检测灵敏度达成pg 级。因为带标识抗体能正确而可靠地反应出抗原位置和数量，且利用二抗可对信号进行放大，所以该方法可用于抗原定性、定量或定位检测。以下是多个常见免疫学技术：1．免疫荧光技术免疫荧光技术是利用荧光素标识抗体（或抗原）检测组织、细胞或血清中对应抗原（或抗体）方法。因为荧光抗体含有安全、灵敏特点，所以已广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。依据荧光素标识方法不一样，可分为直标荧光抗体和间标荧光抗体。间标荧光抗体中一抗并不直接连接荧光素，而是先将一抗结合到蛋白，然后带有荧光素二抗再结合至一抗。经过二抗结合，能将信号进行放大，所以能在一定程度上提升检测灵敏度，不过随之带来高背景也降低了检测特异性。多年来，伴随荧光素和荧光检测技术不停进步，荧光检测灵敏度已经靠近同位素检测水平，直接标识荧光抗体逐步取代间接标识抗体。这些标识了荧光素抗体直接结合至抗原，大大提升了检测特异性，使检测结果愈加正确可靠。荧光检测技术发展，使得免疫荧光技术在传染病诊疗上有广泛用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染疾病，检验IgM抗体，做为近期接触抗原标志。利用单克隆荧光直接标识抗体判定淋巴细胞亚类。经过流式细胞仪，针对细胞表面不一样抗原，能够同时使用多个不一样荧光抗体，对同一细胞进行多标识染色。2．放射免疫检测放射免疫检测技术是现在灵敏度最高检测技术，利用放射性同素标识抗原（或抗体），和对应抗体（或抗原）结合后，经过测定抗原抗体结合物放射性检测结果。放射性同位素含有pg 级灵敏度，且利