BCA实验报告（整理）（一）.pdfVIP

蛋白质的定量测定（BCA 试剂盒法）实验报告 一、实验目的：掌握BCA 法测定蛋白质浓度的方法及原理。 二、实验原理：在碱性的环境下蛋白质与 Cu2+络合并将 Cu2+还原成 Cu1+。BCA 法与 Cu1+ 结合形成稳定的蓝紫色复合物，在 562nm 处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此 可测定蛋白质浓度。 三、实验材料： 实验药品和试剂：BCA Reagent 100 ml （普利莱基因技术有限公司） Cu Reagent 2.5ml （普利莱基因技术有限公司）BSA standard 4mg/ml 1 ml 待测溶液 。 仪器：96 孔板 酶标分析仪（DNM-9602 北京普朗新技术有限公司）移液枪 试管 EP 管 恒温水浴箱。 四、实验方法与步骤： （1）工作溶液配置：将5ml 的BCA Reagent 与 100 μl 的Cu Reagent 混合为 WR 工作试剂。 （2 ）标准蛋白溶液的配置：用上节课已配置好的 0.1M 的PBS 缓冲液进行配比稀释：40 μl 4000 μg/ml BSA+60 μl 0.1M 的PBS=100 μl （BSA=1600 μg/ml ）。 （3 ）倍比稀释：为减小误差，将标准蛋白和待测样本分为三个相同组，每个孔加 25 μl，浓 度从上到下依次增加，H 行为待测溶液。从配置好的 100 μl 标准蛋白溶液中取出 75 μl （浓 度为 1600 μg/ml ），再将75 μl 标准蛋白溶液取出一半到 EP 管中，将 37.5 μl 的PBS 缓冲液 加入取出的蛋白溶液中（浓度为 800 μg/ml ），在EP 管上做好浓度标记，依次倍比稀释，得 到 BSA 标准溶液 1600，800，400 ，200 ，100，50，25 μg/ml ，各 75 μl 。省略 1600 μg/ml 标准管直接从 800 μg/ml 开始。 （4 ）标准测定：在每孔25 μl 标准品或待测样品中，各加入 200 μl WR 工作液轻摇混合。 表 1 微板测定方案的加样量和比例 蛋白浓度（ug/ul） 标准或待测蛋白体积 标号 WR 工作试剂(ul) （ul） A 0 25 200 B 25 25 200 C 50 25 200 D 100 25 200 E 200 25 200 F 400 25 200 G 800 25 200 1 H 待测 25 200 （5 ）反应：将配好溶液的96 孔板 37℃恒温水浴箱放置 30min 。 （6 ）测定：30min 后将 96 孔板放进酶标分析仪中进行结果的检测，以A1 做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值。 （7 ）绘制标准曲线图：根据记录的数据，以浓度为X 轴，吸光度为 Y 轴，绘制标准曲线图。 五、实验结果： 表 2 各孔测得的 OD 值 表 3 浓度及平均值