BCA实验报告（整理）.docVIP

PAGE PAGE 1 蛋白质的定量测定（BCA试剂盒法）实验报告 一、实验目的：掌握BCA法测定蛋白质浓度的方法及原理。 二、实验原理：在碱性的环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA法与Cu1+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 三、实验材料： 实验药品和试剂：BCA Reagent 100 ml （普利莱基因技术有限公司） Cu Reagent 2.5ml （普利莱基因技术有限公司）BSA standard 4mg/ml 1 ml 待测溶液 。 仪器：96孔板 酶标分析仪（DNM-9602 北京普朗新技术有限公司）移液枪 试管 EP管 恒温水浴箱。 四、实验方法与步骤： （1）工作溶液配置：将5ml的BCA Reagent与100μl的Cu Reagent混合为WR工作试剂。 （2）标准蛋白溶液的配置：用上节课已配置好的0.1M的PBS缓冲液进行配比稀释：40μl 4000μg/ml BSA+60μl 0.1M的PBS=100μl（BSA=1600μg/ml）。 （3）倍比稀释：为减小误差，将标准蛋白和待测样本分为三个相同组，每个孔加25μl，浓度从上到下依次增加，H行为待测溶液。从配置好的100μl标准蛋白溶液中取出75μl（浓度为1600μg/ml），再将75μl标准蛋白溶液取出一半到EP管中，将37.5μl的PBS缓冲液加入取出的蛋白溶液中（浓度为800μg/ml），在EP管上做好浓度标记，依次倍比稀释，得到BSA标准溶液1600，800，400，200，100，50，25μg/ml，各75μl。省略1600μg/ml标准管直接从800μg/ml开始。 （4）标准测定：在每孔25μl标准品或待测样品中，各加入200μl WR 工作液轻摇混合。 表1 微板测定方案的加样量和比例 标号 蛋白浓度（ug/ul） 标准或待测蛋白体积（ul） WR工作试剂(ul) A 0 25 200 B 25 25 200 C 50 25 200 D 100 25 200 E 200 25 200 F 400 25 200 G 800 25 200 H 待测 25 200 （5）反应：将配好溶液的96孔板37℃恒温水浴箱放置30min。 （6）测定：30min后将96孔板放进酶标分析仪中进行结果的检测，以A1做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值。 （7）绘制标准曲线图：根据记录的数据，以浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线图。 五、实验结果： 表2 各孔测得的OD值 表3 浓度及平均值 　 1 2 3 A 0.000 0.000 0.000 B 0.000 0.000 0.000 C 0.000 0.000 0.000 D 0.029 0.012 0.014 E 0.111 0.095 0.081 F 0.227 0.209 0.207 G 0.448 0.476 0.466 H 0.619 0.646 0.628 浓度 平均值 0 0.000 25 0.000 50 0.000 100 0.018 200 0.096 400 0.214 800 0.463 X 0.631 图1 标准曲线图将待测溶液吸光度带入公式y = 0.0006x - 0.0219可得待测溶液的浓度为1088μg/ml。 六、结论与讨论： 经过试验最终测得待测溶液的浓度1088μg/ml，本次实验所用BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，经济实用，试剂及形成的颜色复合物稳定性好。本次试验中出现的问题主要有：前三组数据吸光度结果都为0，考虑因浓度太低或者与工作液混合不均匀所导致。 七、注意事项： （1）加入标本时需充分摇匀。 （2）要得到更为精确的蛋白浓度的结果，每个蛋白样品均需做复孔，每次均应做标准曲线。 （3）实用水浴箱时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。 （4）在562nm处测得的光密度值与蛋白质的浓度成正比，所以所做的标准曲线的图形应该为直线图，并且成正比的关系。