酶与蛋白质工程 基因表达与蛋白质分离纯化.pptx

第四讲 基因表达与蛋白质分离纯化; 蛋白质异源表达的关键问题就是发展克隆基因的表达方法，即找到理想的宿主表达系统 目前常用的表达系统有细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞等，这些表达系统各有优缺点;基因表达体系;基因表达体系;基因表达体系;Escherichia coli; 细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，是目前广泛应用的外源基因表达体系。但缺乏真核细胞特有的加工处理，外源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏;载体分类;（１）复制起始点 （２）选择性基因（一般为抗生素抗性基因） （３）强的、可诱导的启动子 （４）强的转录终止序列 （５）核糖体结合位点 （６）合适的多克隆位点;基因表达体系;基因表达体系;基因的融合;为蛋白质的表达和纯化提供方便 蛋白质结构和功能的研究 获得蛋白质的途径（通过体外切割） 与其它不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白 与报告分子共表达，研究蛋白定位及转基因表达 防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST 蛋白表达的空间定位：信号肽 ;基因融合的策略;若使用的linker较长，由于在重组蛋白的生产过程中对蛋白裂解比较敏感，可能会导致融合蛋白产量的降低；同时又涉及免疫原性的问题，因接头序列本身就是新的抗原 应用较短的linker虽可克服蛋白酶分解的问题，但可能使两个大分子相距最近，影响两种蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰，导致蛋白功能丧失，linker序列的组成对融合蛋白的折叠有重大影响 另外，在设计linker序列时，尽量避免二级结构的产生，linker中常见的氨基酸是非极性的疏水氨基酸（Gly、Ser等）; 融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为“亲和尾”（Affinity tail）的编码序列相连接，这段“亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来 ;蛋白纯化 蛋白质的检测和定向固定 提高重组蛋白质的产量 增强重组蛋白质的可溶性及稳定性 ;Protein A GST（glutathione S-transferase） CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein) Thioredoxin **二硫键形成 Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成 SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀;基因表达体系;融合蛋白报告分子 ;基因表达体系;; 1. 启动子结构对表达效率的影响 　　 转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，因此要选择强的可诱导的启动子及相关的调控序列;① mRNA的稳定性：细胞内mRNA的浓度由mRNA转录的速率和mRNA降解之差来决定； ② 翻译的起始：无效的翻译起始多半是蛋白质低表达的最常见问题； ③ 翻译的延伸：遗传密码的简并； ④ 氨基酸的错误搀入； ⑤ 翻译的终止;每种生物对简并密码子的使用频率的差异； 同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量相关； 某些密码子对所有不同基因都是最常用的，如CCG是脯氨酸最常用密码子； 富含宿主不常用密码子的外源基因有可能得不到有效表达;大肠杆菌细胞学结构特点使表达的外源蛋白可能定位在胞内、胞质膜、胞周质、外膜、胞外培养基 （1）胞内表达：小分子蛋白易表达、易水解。大分子蛋白，胞内表达易形成包涵体;（3）细胞外分泌：利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径；利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。分泌至培养基的蛋白容易纯化，减少内源蛋白酶降解; 菌株内蛋白酶太多会导致外源蛋白表达产物不稳定，选用蛋白酶缺失的宿主菌;真核基因在原核细胞中表达及调控;Yeast; 酵母表达系统既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻译后的修饰;5AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇诱导下可启动外源蛋白的表达；