《支原体污染-细胞培养技术》.pptVIP

* 观察肉汤培养管是否变浑浊及pH变化情况,浑浊表示支原体阳性;观察琼脂培养基上支原体集落形成情况,至少3周,有集落形成表示支原体阳性。典型的支原体集落呈油煎蛋样。该方法的缺点是灵敏度低，试验周期长，不能检测到种且不适用于检测所有支原体。 扫描电子显微镜或透射电子显微镜的超级放大功能,可直接观察培养细胞中支原体污染情况。 * * 利用荧光试剂Hoechst33258标记细胞和支原体DNA,在紫外光(波长为630 nm)激发下产生黄绿色荧光,利用荧光显微镜观察支原体是否存在。正常细胞核区见边缘整齐清晰的荧光,胞质区无荧光。 支原体污染细胞集中于胞质一极,可见散在荧光。荧光法的另一种方法是利用针对支原体的荧光标记抗体,与待检细胞孵育后,抗体与支原体结合,荧光显微镜下观察,支原体为荧光亮点。 * * 有支原体污染的细胞,在细胞核外与细胞核表面会出现蓝色荧光小点或丝状点,其形状一致,这与细胞残片染成 不规则点状物不同DNA荧光染色法检测支原体虽然简便易行,但有时易出现假阴性和假阳性, 假阳性主要由于细胞碎片染色被误认为是支原体染色所致,而假阴性可能由于支原体污染较轻,而DNA荧光染色灵敏度不高所导致。 * * 　研究表明,在25株动物细胞中,DNA荧光染色法检出6株(24% )为阳性,4株(16% )为可疑阳性,而PCR法检出9株(36% )为阳性(表1)。通过对比,可以发现,采用DNA荧光染色法检测结果为阳性的细胞样品,用PCR检测结果也是阳性;而采用DNA荧光染色法检测结果为可疑阳性的,采用PCR法检测,结果可能是阳性。 PCR反应体系和条件,能扩增常见污染细胞的支原体,灵敏度高、特异性强、操作简便。 * * 有一部分支原体可侵入到细 胞内部。我们用扫描电子显微镜观察支原体污染细胞时,也 在细胞内看到了支原体。细胞内的支原体可逃避支原体清 除处理。这些细胞内的支原体颗粒可再度离开细胞,去污染 更多的细胞。所以对支原体污染细胞中清除支原体的工作, 实际上是非常困难的,几乎不可能彻底清除支原体。 * * 支原体对热抵抗力差，通常55℃经15分钟处理可使之灭活对影响细胞壁合成的抗生素不敏感，但红霉素、四环素、链霉素及氯霉素等作用于支原体核蛋白体的抗生素，可抑制或影响蛋白质合成，有杀灭支原体的作用 BM-CYCLIN是一种支原体抑制剂 裸鼠过继法：另外比较得到认可的支原体清除方法是将细胞(肿瘤)接种到动物(同基因或裸鼠)体内,利用宿主体内免疫作用,杀死支原体。待肿瘤长至1·0~1·5 cm时,利用肿瘤组织重新进行培养,获得细胞系。笔者实验室对两种污染的细胞做过这样的处理,人鼻咽癌CNE-2Z和小鼠前胃癌MFC细胞,接种到裸鼠。新获得的细胞经PCR法支原体检测均为阴性 * * 目前市场上有新一代支原体抗生素M-Plasmocin(In-vitroGen公司),其含有两种杀菌成分,一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合成受阻。另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制。由于这两种成分的靶分子只存在于支原体和许多其它细菌中而并不存在于真核细胞中,所以可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细菌,同时又不影响细胞本身的代谢,且处理过的细胞不会重新感染支原体,是目前对抗支原体最理想的方法。但是该种药物价格非常昂贵,限制了其广泛应用 * * 在日常细胞培养工作中可采用以下几点来控制支原体的污染问题: 1.从可靠来源引进、使用细胞,特别是知名的信誉良好 的专门机构,如ATCC、基础医学细胞中心等,这些机构对细 胞质量进行一系列检测。 2.预防为主:细胞培养实验室应制定严格的管理制度, 按照规范的实验程序操作。 3.定期对实验室中的培养物进行支原体检测。这也是国外一些重要实验室的经验。一旦发现已经污染支原体的 培养物,灭活后弃之。更换新的培养物。避免支原体的进一 步播散。 * 支原体污染-细胞培养技术 2 * 支原体污染易被忽视 1.培养液可不发生混浊 2.细胞病理变化轻微或不显著 3.细微变化也可由于传代，换液而缓解。 4.个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落 2 * 支原体高污染率 国内外研究表明，在细胞培养中，支原体感染率达到30-60% 支原体污染已成为世界问题！ 2 * 支原体的生物特性 ◆是目前发现的最小细胞，直径约为0.13-0.18μm。 ◆无细胞壁，不能维持固定的形态，变形能力大。 ◆革兰氏染色不易着色或呈阴性。 ◆胞膜中含有胆固醇或其他甾醇。 ◆多数支原体适合在偏碱性条件下生存（pH值7．6~8．0），对酸耐受性差。 ◆对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 2 * 支原体污染的类型 口腔支原体(M.orale) 精氨酸支原体(M.arginini) 猪鼻支原体(M. hyorhinis) 发酵支