大肠杆菌表达系统及蛋白表达纯化.docx

8 . 大 肠 杆 菌 表 达 系 统 与 蛋 白 表 达 纯 化 大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点 , 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。 因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特 点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决 策略。 8.1 大肠杆菌表达系统的选择与构建 根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子， 如 λ PL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的 IPTG 诱导的启动子， 如 lac ，trc ，tac ， T5/lacoperator ，T5/lacoperator 等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的 N 端或 C 端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合 标签包括 Poly-Arg ， Poly-His,Strep-Tag Ⅱ， S-tag ， MBP His-Tag 和 GST-Tag HisTag 大 等。其中 是目前使用最多的。 His 融合于目标蛋白的 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 多数是连续的六个 N端或 C 端，通过 His 与金属离子： Cu >Fe >Zn >Ni 的螯合作用而实现亲和纯化，其中 Ni 是 目前使用最广泛的。 His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的 N端和 C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用 的表达载体主要是由 Novagen提供的 pET系列和 Qiagen 公司提供的 pQE系列。 除了 His 标签外，还原性谷胱甘肽 S- 转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与 His 相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠， 提高目标蛋白表达的可溶性， 因此，对于那些用 his 标签表达易形成包涵体的蛋白， 可以尝试用 GST 融合表达来改进。当然， GST具有较大的分子量（ 26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除 GST是必须的。目前， GST融合表 达系统主要是由 GEHealthcare （原 Amersham ）提供。 重组质粒的构建一般选择遗传稳定， 转化效率高， 质粒产量高的菌株作为受体菌， 常用的有 E.coliDH5 α ，E.coliJM109 ，E.coliDH10B ， E.coliNovaBl μe 等 rec A– 和 endA– 型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过 程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主： BL2 lon 和 ompT Tac Trc ， Lac λPL cspA ： 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于 ， ， ， 等作为启动子的载体。 BL21 DE3 DE3 BL21 形成的带有染色体 T7RNA IPTG 诱导的 lac Μ V5 启动子控制 T7RNA （ ）： 噬菌体溶源于 聚合酶基因大肠杆菌。 聚合 酶基因表达 T7RNA聚合酶，进而控制 T7 表达系统表达目的蛋白。 BL21 DE3 T7 表达系统 BL21 DE3 Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。 Origami DE3 （ ）衍生系列：在经典的 （ ）的基础上， gor 比如： （ ）， OrigamiB （ DE3 Rosetta-gami （ DE3 trxB 和 双突变。拥有 trxB 和 gor 突变的菌株比单具， trxB 突变的菌 ）和 ）菌株带有 株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。 Rosetta? 系列：是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有 tRNA水平，可以提高一些真核基因表达效率（更 多信息可参考相应公司的资料）。 BL21-CodonPlus 系列：包括 ? ） ， μ ， μ （ ） （ BL21-CodonPlus DE3-RIPL BL21-CodonPl s?-RIL BL21-CodonPl s? DE3 -RIL,BL21-CodonPl μ ， ? （ ） 等。这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（ ），亮氨酸（ ）， s?-RP BL21