13应生张寿丽-实验二-光合色素的提取、理化性质-、-分离、吸收光谱及含量的测定.docx

专业：应用生物科学 班级：13 应生 姓名：张寿丽 学号：134120258 实验二、光合色素的提取、理化性质、 分离、吸收光谱及含量的测定 一、实验目的： 1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。 2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。 3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。 二、实验原理： 1、光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。 2、提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。 3、离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。 4、叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。 5、叶绿素分子中 Mg2+与仆啉环结合不稳定， 可以被 H+、Cu2+、Zn2+ 等离子所取代。 6、不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对 它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。 7、叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收， 主要是红光和蓝紫光。 8、混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重 叠，仍然可以根据 Lambert-Beer 定律（ A = k L C ）求出各组分含量。 Lambert 定律： A = k L ；Beer 定律 A = k C 。叶绿 a、b 在 80%丙酮溶液中的 Amax分别为 663nm、645nm，由此得出：见推导过程 Ca = 12.7 A663 – 2.69 A645； Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A645 9、A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1 A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2 分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。 10、k——比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓 (C) 为 1g/L(0.1%) ，比色皿的直径 ( 光径， L) 为 1cm 时所测出的吸光度即为比吸收系数。 11、ε——摩尔吸收系数。 即溶剂和波长不变的情况下， 当物质的浓度 (C) 为 1mol/L ，比色皿的直径 ( 光径， L) 为 1cm 时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。 三、实验药品及仪器： （一）、材料： 叶子花的叶片。 （二）、药品： 碳酸钙、石英砂、丙酮、 30%KOH甲醇溶液、苯、 50%醋酸、醋酸铜、 80%丙酮、石油醚。 （三）、仪器： 解剖剪、滤纸、漏斗、吸量管、试管，三角瓶、洗耳球、离心管、研钵、酒精灯、分光光度计、便携式叶绿素测定仪、离心机、试管夹、试管架。 四、方法及步骤： （一）、光合色素的提取： 将植物叶片洗净并用滤纸洗干， 取 1/2 片叶片，放入研钵中并加入少许 CaCO3和石英砂及 5 ml 丙酮，充分研磨，再加入 10 ml 丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 1、荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。 2、光破坏作用： 1ml 色素提取液于室内， 1ml 于太阳光下， 30min 后观察颜色变化。 3、皂化反应：取一支试管，加入色素提取液 2.5ml ，再加入 30%KOH 甲醇溶液 1ml，摇匀，再加入苯 2.5ml ，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水 1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的 变化。 4、取代反应：取一支试管，加入 3ml 色素，逐滴加入 50%醋酸直至溶液变为黄褐色。 倒出一半， 加入少许醋酸铜粉末， 酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。 （二）、光合色素的分离和吸收光谱： 1、光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取 1/3 片叶片，放入研钵中并加入少许 CaCO3和石英砂及 5 ml 丙酮，充分研磨，再加入 10 ml 丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 2、光合色素分离： 剪取适当长度和宽度的滤纸条→ 用上行纸层 析法分离色素→ 启动剂：石油醚：丙酮：苯 =10：2：1。 3、吸收光谱的测定： （ 1）、光合色素的吸收光谱：取色素溶液 1 mL，加入丙酮 3 mL，摇匀后在分光光度计上 400 到 700 nm 处每隔 10 nm 进行扫描。 2）、各色素的吸收光谱：上述层析出的 3~4 种色素，分别剪下后溶于 3 mL 丙酮中，按上述方法扫描。 （三）、光合色素含量的测定： 1、快速测定法：由于叶绿素 a、b 在 652nm处有共同吸收， k = 34.5 L g-1. cm-1 。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为 mg/dm2 2、分光光度计法： 色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知Φ的叶圆片 0.05g ，加入少许 CaCO3和石英 砂及 80%丙酮 2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用） ，再用 5ml 8