载体与目的基因连接.pdf

一 . 重组质粒的构建 T 质粒载体 重组的 DNA分子是在 DNA连接酶的作用下，有 Mg2 、ATP 存在的连接缓冲系统 中，将分别经酶切的载体分子与外源 DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种： T4 噬菌体 DNA连接酶和大肠杆菌 DNA连接酶。两种 DNA连接 酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA分子连在一起的功能，而且 T4 噬菌体 DNA连 接酶还有一种大肠杆菌 DNA连接酶没有的特性， 即能使两个平末端的双链 DNA分子连 接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高 T4 噬菌体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分为 3 步：首先， T4 DNA 连接酶与辅因子 ATP 形成酶 -ATP 复合物；然 后，酶 -ATP 复合物再结合到具有 5’磷酸基和 3’羟基切口的 DNA上， 使 DNA腺苷化； 最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断 相连。 很多 DNA聚合酶在进行 PCR扩增时会在 PCR产物双链 DNA每条链的 3’端加上一 个突出的碱基 A 。 pUCm-T 载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的 3’端带有一 个突出的 T。这样， pUCm-T 载体的两端就可以和 PCR产物的两端进行正确的 AT 配对， 在连接酶的催化下，就可以把 PCR产物连接到 pUCm-T 载体中，形成含有目的片断的 重组载体。 连接反应的温度在 37 ℃时有利于连接酶的活性。 但是在这个温度下粘末端的氢键 结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即 12-16 ℃，连接 12-16h （过夜），这样既 可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 二 . 感受态制备原理 细菌在 0°C CaCl 2 低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易 吸收外源 DNA的感受态。 三 . β- 半乳糖甘酶显色反应选择法 LacZ 基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码 β—半乳糖核苷酶。 β—半乳糖核苷酶是由 4 个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用 X-Gal 为底物 进行染色时，呈蓝色。 现在一些特定的质粒（比如 pUC/pBS 等），常带有 β—半乳糖核苷酶的调控序列 和 β—半乳糖核苷酶 N 端 146 个氨基酸（ α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还 插入一个多克隆位点（ MCS）, 它并不影响 lacZ 的表达。另外，常用的大肠杆菌带有 β—半乳糖核苷酶 C 端部分序列（ β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这 些质粒与大肠杆菌各自编码的 β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。 只有当携带 α 肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物 IPTG 的诱导下，载体质 粒能够合成 β—半乳糖核苷酶 N 端（ α肽段），这样就与宿主细胞合成的 β—半乳糖 核苷酶 C 端部分序列（ β肽段）互补，形成完整的 β—半乳糖核苷酶活性蛋白。 而当外源基因插入到此种载