(完整word版)植物内生菌DNA提取方法.doc

在提取植物内生菌之前， 植物需要表面灭菌， 其具体操作为将植物浸泡在添加了 0.02%的 Tween-20 的质量分数为 1%的次氯酸钠溶液中 1 min，再将植物浸泡在 70%酒精中 1 min，然后用硫代硫酸盐 /Ringer ’s（林格氏液）清洗 3 次，每 . 1 min。根和茎（土表面以上 1 cm 处）都要灭菌处理，将根茎切成片状。为了更好地分析细菌的位置， 灭菌后茎表皮撕下， 茎内部按照之前的方法灭菌。 表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取 DNA 。 植物不同组织的内生菌群落 DNA 提取通过直接研磨植物组织， 步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一） ，或者在 DNA 提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）。 东南景天表面灭菌方法： 整株植物用自来水冲洗 30 min，用蒸馏水洗 3 次，每次 3 min。用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与 植物地上部分开。将根系用 70 %酒精浸泡 2 min，无菌水洗 3 次， 3 % NaClO 浸泡 2 次，每次 1 min ，然后用无菌水冲洗 3 次，每次 2 min，最后一次清洗液涂 LB 平板。 将 2 g 左右消毒后植物组织于无菌研钵中， 加 5 mL 磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4· H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到 1 L）研磨至匀浆。 将植物匀浆转移至 50 mL 无菌离心管 中，摇床 200 rpm 振荡 1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。 取 4 mL 悬液于新的无菌离心管中， 12 000×g 离心 10 min 收集菌体细胞。 4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于 550μL 1×TE buffer （Tris-EDTA ；pH8）中加入 10 mg mL-1 溶菌酶 10μL ， 37℃水浴 1-4h。 加入 50μL 20% SDS 和 8μL 20 mg mL -1 蛋白酶 K ，混匀，65℃水浴 3h， 期间轻轻上下颠倒混匀数次。 加入 200μL 5 M NaCl ，涡旋振荡 15 s， 12000×g 离心 10 min。 7．取上清液， 并向上清液中加入等体积的 氯仿 -异戊醇（24:1），彻底混匀， 12000×g 离心 10 min。 上清液转移至新的无菌离心管中，重复步骤 7 一次。 9. 上清液转移至新的无菌离心管中，加入丙醇，4℃放置 1 h。  0.6 倍体积（ 0.6 vol）的冰冷的 异 4℃， 12000× g 离心 10 min，弃上清。 沉淀用 70 % 冰乙醇清洗，离心，弃上清。 DNA 沉淀室温风干后，用无菌超纯水溶解。 13. DNA 纯化采用 TIANquick Midi Purification Kit 。 微生物 16S rRNA 基因 V5 -V6 -V7 区域扩增引物： 799F2：GATGG CCATT ACGGC CNNNN NN 1193R：ACGCA TCCCC ACCTT CCTC 用含 10 % SDS 提取缓冲液 (NaP 缓冲液 )重新悬浮细胞团块。 用直径 0.11mm 的玻璃珠珠打操作 50 s，以溶解细胞。用苯酚 -Tris (pH 8)溶液和氯仿 /异戊醇提取，用 0.6 vol 的异丙醇和 0.5 mol/L NaCl 通过沉淀再次获得 DNA 。用 70 %的乙醇洗涤细胞团块，真空干燥，再溶解在 50μl 的超纯水中。原始 DNA 提取物用 Glassmilk purification kit (Bio101, La Jolla, CA) 进一步纯化。 所需试剂： Na2HPO4·H2O，NaH2PO4·2H2O，10 % SDS（十二烷基硫酸钠） ， Tris 饱和酚，氯仿 /异戊醇（体积比 24:1 混合），异丙醇， 0.5 mol/L NaCl ， 70 % 乙醇。 苯酚、氯仿、异戊醇在 DNA提取时的作用 抽提 DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？ 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时， 蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去， 使蛋白失去水合状态而变性。 经过 离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的 DNA 分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约 10％～ 15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的 DNA ，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走 DNA 。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中