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质粒图谱的阅读
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一、一个合格质粒的组成要素? 复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。? 抗生素抗性基因 可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+? 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段? P/E 启动子/增强子? Terms 终止信号? 加poly(A)信号 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。(1)Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。(2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。(3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。(4)neor(kanr) 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418(长那霉素衍生物)失活(5)hygr 使潮霉素β失活。第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号? 启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。? 增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,负调控序列。? 核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。? 转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。回答有人之前提出的一个问题:为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上.三、介绍一下关于载体的知识(虽然课本上都有写)1. 什么是载体即要把一个有用的基因(目的基因??研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA2. 载体的分类———按功能分成:(1)克隆载体 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(所以有时实验时扩增效率低下,要注意是不是使用的严谨行载体)(2)表达载体 具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。———按进入受体细胞类型分:(1)原核载体 (2)真核载体 (3)穿梭载体(sbuttle vector) 指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间).P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子,以确保两类细胞中都能扩增。3. 基因工程载体的3个特点:(一)都能独立自主的复制:载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域,如MCS,插在其中的外源DNA片段,能被动的跟着载体一起复制/扩增,就像载体的正常成分一样。(二)都能便利的加以检测: 如载体的药物抗性基因,多是抗生素抗性基因,将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时,只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。(三)都能容易进入宿主细胞中去,也易从宿主细胞中分离纯化出来。4. 载体的选择和制备:选择载体主要依据构建的目的,同时要
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