叶绿体的提取.docxVIP

叶绿体的分离 原理： 研磨叶片得到的匀浆，经过滤、 离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲液溶液中， 0~4 度温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。 仪器与用具： 冰箱；离心机；扭力天平；显微镜； pH 计；研钵；量筒；移液管；离心管；脱脂纱布等。 分离器皿都须在 0 度下预冷。 试剂： 1. 分离介质：含 0.33 mol/L 山梨醇，50 mmol/L Tris-HCl （或 Tricine ）pH7.6 ，5 mmol/L MgCl 2， 10 mmol/L NaCl ，2 mmol/L EDTA ， 2 mmol/L 异抗坏血酸纳。 配法：称 60 g 山梨醇、 6.06 g Tris、1 g MgCl 2·6H 2O、0.6 g NaCl 、0.77 g EDTA-Na 2、0.4 g 异抗血酸钠，溶解后用 1 mol/L HCl 调 pH 至 7.6，定容至 1000 ml 。 2. 悬浮和测定介质Ⅰ： 0.66 mol/L 山梨醇， 2 mmol/L MgCl 2 ，2 mmol/L MnCl 2，4mmol/L EDTA ， 10 mmol/L 焦磷酸钠， 100mmol/L Tris-HCl pH7.6 。 配法：称 60g 山梨醇、 0.2g MgCl 2· 6H2O、 0.2g MnCl 2· 4H 2O、 0.75g EDTA-Na 2、2.23g Na4P2O7· 10H2O、 6.06g Tris，溶解后用 1 mol/L HCl 调 pH 至 7.6，定容至 500ml 。 3. 悬浮和测定介质Ⅱ：测定介质Ⅰ稀释 1 倍。 方法： 1. 选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片，洗净后去除中脉，放入 0~4 度 冰箱或冰瓶中预冷。 分离介质 30~50ml ，置于研钵中，并在冰箱中预冷至现薄冰。 3. 取冷却的菠菜叶片 10~20g，撕碎后放入研钵，用手工快速研磨 0.30~1min ，注意不要用 力过猛，也不必研磨过细，以叶片磨成小块时即可，研磨后将匀浆用两层新纱布过滤。 4. 将滤液装入预冷过的两个离心管，经天平平衡后，用离心机以 1000r/min 离心 2min。 5. 倾去上层液，沉淀即为叶绿体。随后每管加 2ml 悬浮和测定介质Ⅱ，并用吸管冲散沉淀。 叶绿体悬浮液合并后放冰瓶中备用。 6. 用滴管吸取少量叶绿体，加少量悬浮和测定介质Ⅱ稀释，置显微镜（ 400~600 倍）下，观 察叶绿体的形态。 叶绿体被膜完整度的测定 原理： 由于铁氰化钾不能透过被膜，故完整叶绿体在等渗介质中不能进行铁氰化钾光还原的 Hill 反应。而失去完整被膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行 Hill 反应。而失去完整被 膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行 Hill 反应。根据这一原理，比较胀破的叶绿体 Hill 反应速率就可以计算叶绿体被膜的完整度。 仪器与用具：氧电极测氧全套装置 Rubisco（RuBP 羧化酶）活性的测定 原理： 根据 Cavinl 循环得知，在 RuBP 羧化酶作用下 1 mol RuBP 与 1 mol CO 2 反应生成 2 mol 3- 1 磷酸甘油酸，后者在 3-磷酸甘油酸激酶和 3-磷酸甘油醛脱氢酶作用下，被 NADH 还原成 3- 磷酸甘油醛，其反应如下： RuBP 羧化酶， Mg 2+ RuBP+CO 2 + H 2O ←—————————→ 2× 3-PGA 3-PGA 激酶， Mg 2+ 2× 3-PGA + 2ATP ←—————————→ 2× 1，3-二磷酸甘油酸 + 2ADP 3-磷酸甘油醛脱氢酶 + 2× 1， 3-二磷酸甘油酸 + 2NADH ←—————————→ 2× 3-二磷酸甘油酸 + 2NAD +2Pi 从上述总式可以看出，每固定 1 mol CO 2 就有 2 mol NADH 被氧化， NADH 的减少量可用分 光光度计在 340 nm 下测出，进而计算出 RuBP 羧化酶的活性。 仪器与用具： 分光光度计；冷冻离心机；自动部分收集器，蛋白质检测仪；凝胶电泳装置； Sephadex（葡 聚糖）层析柱（长度与直径视所提蛋白的质量而定） ；恒温水浴；匀浆器；纱布。 试剂： 2