生物化学实验：第四次实验.docVIP

氨基酸的纸层析法 一．实验目的 1．掌握纸层析的一般原理和方法步骤； 2．了解氨基酸的特征性颜色反应； 3．学会分析未知样品的氨基酸成分。 二．实验原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三．实验仪器 1、?新华滤纸 2、?层析缸 3、?细线 4、?点样管 5、?橡皮筋 6、?电吹风 7、?喷雾器 四．实验试剂 1、?混合氨基酸（酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五．实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。 4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃ 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。 6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。 7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看） 六．实验结果 Rf值=原点到层析斑点中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离 Rf甘氨酸=0.5/12.0=0.0417 Rf1=0.5/12.0=0.0417 Rf2=3.05/12.0=0.2542 从层析纸上看，混合的氨基酸是甘氨酸和苯丙氨酸两种氨基酸的混合。 甘氨酸苯丙氨酸 甘氨酸 苯丙氨酸 七．思考题 1．哪些因素影响Rf值？ 答：1. 展开剂种类 粘稠展开剂(正丁醇等) ------ 快速滤纸 黏度小的展开剂(石油醚等) ------慢速滤纸 2. 滤纸的性质 3. 温度的影响 影响分配系数的变化，而且展开剂组成也受温度影响而有一定程度改变，但影响较小。一般不需要特别的恒温装置 4 . 展开方式 上行 ---- 慢(常用) 下行---- 快( 适用于比移值小的溶质). 2. 实验操作中, 为何不能直接用手接触滤纸? 答：因为在人的手的表面会有一些氨基酸附着，如果用手碰了滤纸，手上的氨基酸会影响实验结果。