生物化学实验：第五次实验.docVIP

维生素C的定量测定（2，6-二氯酚靛酚滴定法） 目的 掌握2，6-二氯酚靛酚法测定维生素C的原理和方法 原理 维生素C又称抗坏血酸。在1928年，从牛的肾上腺皮质中提出的结晶物质，证明对治疗和预防坏血病有特殊功效，因此成为抗坏血酸。 还原型抗坏血酸能还原染料2，6-二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2，6-二氯酚靛酚呈红色，被还原后呈无色。 因此，可用2，6-二氯酚靛酚滴定样品中的还原型抗坏血酸。当抗坏血酸全被氧化后，少多加一些染料，是滴定液呈淡红色，即为滴定终点。如物其他杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量呈正比。 实验器材 新鲜水果（猕猴桃） 吸管 容量瓶 微量滴定管 电子分析天平 研钵 漏斗 实验试剂 1、2%草酸溶液：草酸2g溶于100ml蒸馏水中。 2、1%草酸溶液：溶1g草酸于100ml蒸馏水中。 3、标准抗坏血酸溶液（0.1mg/ml）：准确称取50.0ml纯抗坏血酸，溶于1%草酸溶液，并稀释至500ml。贮于棕色瓶中，冷藏，最好临时配制。 4、1%HCl溶液。 5、0.1%2，6-二氯酚靛酚溶液：溶500mg2，6-二氯酚靛酚于300ml含有104mgNaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至500ml。滤去不溶物，贮棕色瓶内，冷藏（4oC约可保存一星期）。每次临用时，以标准抗坏血酸液标定。 操作 将水果用水洗净，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取5.0g，加2%草酸20ml置研钵中研至浆状。称取浆状物5.0g，倒入50ml容量瓶中以2%草酸溶液释至刻度。静置10min，过滤（最初数毫升滤液弃去）。滤液备用。 样液滴定：准确吸取滤液两份，没分10.0ml分别放入两个100m锥形瓶内，加入草酸，微量滴定管以0.1%2，6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持15s钟即为终点。由所用染料的体积计算出1ml染料相当于多少mg抗坏血酸。 注意：滴定过程宜迅速，一般不超过2min。滴定所用的染料不应少于1ml或多于4ml，如果样品含抗坏血酸太高或太低，可酌量增减样液。 计算 m=(VT/m0) ×100 式中 m：100g样品中含抗坏血酸的质量（mg）； V：滴定时所用去染料体积数（ml）； T：每毫升染料能氧化抗坏血酸质量数（mg/ml）； m0：10ml样液相当于含样品的质量数（g）。 实验结果 实验次数 1 2 滴定前染料体积（ml） 0.17 0.86 滴定后染料体积（ml） 0.83 1.53 体积差 0.66 0.67 平均值 0.665 m=0.665×100=66.5mg 问题讨论： （一）、2，6-二氯酚靛酚试剂法测定维生素C含量的优缺点？ 优点：该法简便易行、快速。 缺点：滴定终点难以确定，利用2.6一二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性物质溶液而当抗坏血酸尚未被全部被氧化时，滴下的2.6一二氮酚靛酚立即被还原成无色。而溶液中的坑坏血酸一旦被氧化，则滴入的2.6一二氮酚靛酚则立即使溶液呈现红色。所以，当溶液从无色转变成微红色时，即表示溶液中的抗坏血酸刚刚被全部氧化，此时为滴定终点。此种方法对于无色或淡黄色、绿色样品液的滴定终点易确定，而对于山植、大枣、草葺、酸枣等紫色、粉红或褐色等色泽的朵蔬样品液的滴定终点就难以观察确定。为此，往往经稀释，添加活性炭、白陶土来进行脱色处理，添加维生素C的方法来解决。既使如此，仍难得到满意的结果，测定数据也很难准确。 （二）此方法误差来源是什么？ 2.6－二氯酚靛酚钠不稳定，储存在棕色瓶中，保存在低温下,必须在一周内用完,用前必须标定. 0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150ml含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至250ml，贮于棕色瓶中冷藏（4℃）约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。