上海交大网络课程检验微生物讲义15.doc

精品 第 23 章 病毒感染的实验诊断 一、 教学大纲要求 1 ）标本的采集、处理与运送注意事项 2 ）病毒形态学检查方法 3 ）病毒的分离与鉴定程序及方法 4 ）病毒感染的快速诊断方法 二、 教材内容精要 （一）标本的采集、处理与运送 根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采 集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活， 标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油 或二甲基亚砜（ DMSO ）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在 -70 ℃低温冰箱内保存。 （二）病毒形态学检查 1.光学显微镜 仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。 2.电子显微镜检查法 1 ）电镜直接检查法 某些病毒感染的早期，临床标本中就可出现病毒颗粒。标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电 镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。 （ 2 ）免疫电镜检查法 将病毒标本制成悬液， 加入特异性抗体、 混匀，使标本中的病毒颗粒凝集成团， 再用电镜观察， 可提高病毒的检测率。本法比电镜直接检查法更特异，更敏感。 welcome 精品 超过滤法 用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或 用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。 4.超速离心法 根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数（ S），借以计 算病毒的大小。 5.X 线晶体衍射法 根据 X 线衍射图谱， 用数学方式处理来研究病毒结构亚单位和分子结构等。 但标本必须为结晶， 可用于无包膜病毒的研究。 （三）病毒的分离与鉴定 1.病毒分离培养 实验室分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种、鸡胚接种和组织培养。根据细胞的来源、 染色体特性和传代次数的不同，可分为：原代和次代细胞培养，二倍体细胞培养，传代细胞培养。 病毒在培养细胞中增殖的指标 （ 1 ）细胞病变效应（ cytopathic effect ， CPE）。 （ 2 ）红细胞吸附 （ 3 ）干扰现象 （ 4 ）细胞代谢的改变 3. 新分离病毒的鉴定 （ 1 ）病毒核酸类型的测定 用 RNA 酶及 DNA 酶可鉴定出病毒核酸的类型。另外， DNA 病 毒受 5- 氟尿嘧啶的抑制，而 RNA 病毒不受影响。用此方法亦可区分 DNA 与 RNA 病毒。 （ 2 ）理化性状的检测 对脂溶剂的敏感性：有包膜的病毒（如正粘病毒、副粘病毒、逆转录 welcome 精品 病毒等）含有脂类，对乙醚、氯仿和胆盐等脂溶剂均敏感，经作用后病毒失去感染性，而无包膜的 病毒对脂溶剂有抵抗。 耐酸性试验：肠道病毒与鼻病毒均属于小 RNA 病毒科，均耐乙醚。但前者可 耐 pH3 ，而后者在 pH3~5 环境中很快被灭活，故可将两者相区别。 3 ）血清学鉴定 病毒型别的最后鉴定必须依靠血清学方法。将分离的病毒与已知的诊断血清作各种试验进行鉴定。 （四）病毒的血清学检测 血清学试验是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的主要方法之一。血清学试验的方法很多，最常用的如中和试验、补体结合试验、血凝及血凝抑制试验等。 中和试验 中和试验是病毒型特异性反应，是指应用特异性抗体中和病毒的致病性或感染性的试验。将病 人血清与一定量的已知病毒混合，作用一定时间后，接种于实验动物、鸡胚或细胞培养中，观察病 毒的致病作用是否被中和而不出现感染指标。以此判断病人血清中有无特异性抗体存在。本法特异 性高，但操作比较复杂，费时。主要用于鉴定病毒；分析病毒抗原的性质；测定免疫血清的抗体效 价和疫苗接种后的效果；测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病。 2.补体结合试验 特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体。本实验操作繁琐，特异性较 中和试验低，但补体结合抗体出现早，消退快，有助于早期诊断。主要用于流行病学调查；病毒病 的诊断；疫苗使用后人群抗体情况调查；检测病毒抗原；鉴定病毒属。 血凝及血凝抑制试验 血凝试验和血凝抑制试验为型特异性反应，其原理为某些病毒或病毒血凝素能选择性地引起个 别种类的哺乳动物的红细胞发生凝集，当加入相应的特异性抗体时，这种凝集现象即被抑制。主要 用途为发现与鉴定病毒；诊断病毒病；病毒分型；免疫机体后抗体效价的测定；浓缩病毒；病毒抗 welcome 精品 原分析（某些病毒可用交叉血凝抑制试验分析抗原成分） ；病毒株变异相的测定等。 凝胶免疫扩散试验 以半固体琼脂糖为支架所进行的抗原、 抗体的沉淀反应。 本方法简便， 特异性与敏感性均较高， 而且衍生出对流免疫电泳和火箭电泳等更为敏感的检测技术。此法在病毒性疾病中主要用于诊断 HBV 与