凝胶层析法测蛋白质分子量.docxVIP

一、 实验目的 了解凝胶层析的原理及其应用。 通过测量蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。 了解洗脱曲线、选择曲线的意义，并学会绘制洗脱曲线、选择曲线。 二、 实验原理 蛋白质分子量的测定 蛋白质是生命过程中最重要的物质之一，近年来已成为生命科学领域的研 究热点⑴。分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时， 首先应准确测定其分子量。蛋白质分子量的测定方法有多种，如渗透压法、光散 射法、超速离心法、凝胶层析法及聚丙烯酰胺凝胶电泳等 [2-4]。 凝胶层析法 层析法，又称色层分析法或色谱法(Chromatography)，在1903-1906年由 俄国植物学家首先提出。虽然近年来质谱技术日益成熟 ，灵敏度、精确度也为各 种方法之首，但是目前在实验室中测量蛋白质分子量应用比较广泛的还是凝胶层 析等方法呵。 凝胶层析法(gel filtration )，又叫凝胶过滤法、凝胶渗透色谱法(GPC)、 排阻色谱法、凝胶过滤色谱法(GFC)、分子筛层析法(molecular sieve chromatography )等⑹，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。 凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，如同过筛可以把 大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在 适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物， 再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的 空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外， 从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 由于其分离条件温和、 样品回收率高、实验的重复性高、设备简便经济等 特点，是目前最广泛使用的生化物质的分离方法之一，是所有色谱技术中 最简单、条件最温和的方法，且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。 虽 然其分离效果不及高效液相色谱，但可作为一种初步的分离手段使下一步的纯化 达到更好的效果⑺。 （三） 凝胶 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很微细的多孔 网状结构。常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（ agarose gel ，商品名 Sepharose），人工合成凝胶是葡聚糖（ dextran，商品名为 SePhadex）， 凝胶型号不同，孔隙度不同，但都不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小 有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应 的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大， 适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 （四） 测量方法 凝胶过滤层析，是一种分离不同大小分子的分配层析 ，被分离物 质的分子在溶剂和限定孔径的凝胶固定相中被分配 ，混合物随流动相流 经层析柱时，各种物质同时进行着垂直向下的运动和无定向的扩散运动 混合物中各物质因相对分子质量的大小不同而被分离 ，这种方法操作简 便，费用较低，重复性好⑹。因其能像筛子一样筛分不同大小的分子， 因 此又称为“分子筛”。其具有许多良好的性能，因此在蛋白质的分离分 析中被广泛采用。经过不少人的实际应用和完善，该方法已经变成一种 可靠的测定高分子分子量的方法 [9]。 将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积” ，以Vt （ total volume ）表 示。Vt由三部分组成，即 Vt=Vo+Vi+Vg。Vo称为“孔隙体积”或“外体 积”（outer volume ）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面 空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积； Vi为内 体积（inner volume ），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的 体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和 吸水后的重量求得； Vg为凝胶本身的体积。 而洗脱体积（Ve，elution Volume ）与Vo及Vi之间的关系为： Ve=Vo+Kd - Vi Ve是自加入样品时起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；本 实验凝胶层析柱中填充的是交联葡聚糖，含有蛋白的溶液通过管柱时， 大分子的蛋白呈正态分布连续首先流出，会形成一个蛋白峰 [10] o Kd为样 品组分在二相间的分配系数，也可以说 Kd是分子量不同的溶质在凝胶内 部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大 小分布有关，而与柱的长短粗细无关。 Kd可通过实验求得： Kd= ( Ve- Vo ) /Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积； Vo可用不被凝胶滞留的大分子物 质的溶液(带颜色为佳，便于观察，如血红蛋白、印度黑墨水等，分子 量约200万的蓝色葡聚糖-2000等)通过实际测量求出； Vi可由g ? WR 求得(g为干凝胶