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实验一 MS 培养基配制和灭菌 一．目的和要求 ： 学会 MS 培养基的制作方法 ; 掌握高压灭菌的方法和基本操作。二、仪器与试剂 仪器：灭菌锅、解剖刀、枪状镊子、烧杯（ 500ml）、培养皿、移液管等 试剂：MS的 Macro-e、Micro-e、有机母液、 Fe盐、肌醇蔗糖，琼脂粉， 1N NaoH 和 1N HCl 三、方法步骤 （一）配方设计 : 以 MS 为基本培养基（ mg/L） No. 6-BA NAA IBA CK 0 0 1 2 3 4 5 （二） 配制培养基 溶化琼脂：量取 300ml左右蒸馏水，加入 4.8g琼脂粉，加热溶解直至完全 融化。 各种母液的吸取： Macro-e50ml Micro-e 1ml 有机成分 1ml Fe盐 5ml 肌醇 10ml 加在一起，倒入烧杯（ 1L) （3）加入糖 :称取 30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的 300ml 蒸馏水中。 （4）根据实验设计，量取生长调节剂 :加在一起，倒入烧杯。 （5）定容 :加蒸馏水（用量杯）。 （6）调节 pH至，用 pH试纸进行测定，用 1molHcl或1Mol NaoH调节。 （7）分装 :30～40 ml/瓶 6，培养基勿碰三角瓶口。 （8）用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、 烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。 （三）灭菌：用高压蒸汽消毒器灭菌， 其压力为～ ,温度为 120～126℃，保持 15~20 min。 具体操作步骤： 加水； 把包扎好的培养基装入高压锅； 盖上热压锅盖 ,上紧螺帽 (注意对角拧紧螺帽 )关上气阀和安全阀； 加热； 排除冷空气； 排除冷空气后 ,关闭放气阀，待压力升到 1Kg 位置时，开始计算灭菌时间，一般在 1Kg 压力 (121℃)下灭菌 15~20 分钟即可，但要注意保持稳定压力。 灭菌时间达到 20 分钟后，停止加热，待压力自动降到 0磅时，打开放气阀，打开热压灭菌锅盖 (注意对角扭松螺帽 )稍待冷后再把培养基取出。 四 .作业 总结配制培养基的注意事项。 制作培养基前为何要提前配制母液 实验二 短柄五加无性系建立 一．目的和要求 ： 学习并掌握外植体的消毒方法及具体操作 ; 掌握无菌操作技术。二、材料、仪器与试剂 1.材料：短柄五加休眠枝 短柄五加 ( Eleutherococcus brachypusHarms.) 为五加科五加属灌木，在我国的分布范围极其狭窄， 主要分布于西北黄土高原， 逐渐被认为是濒危植物。 其茎具有较高的药用价值，有治疗神经衰弱、妇女更年期综合症、继发性高血压、白细胞减少等功效。 2.仪器：超净工作台、灭菌锅、弯头剪、枪状镊子、烧杯（ 500ml）、培养皿 等 3.试剂：配制好的 MS培养基各种母液、 1mol/L的NaOH、1mol/LHCL、%的升汞、 70%的乙醇。 三、方法步骤 (一) 无菌操作 准备阶段 接种室： 1、紫外灯提前照 20-30min。 2、 70%乙醇或新洁尔喷雾消毒。 操作人员： 1、穿专用实验服，戴口罩。 2、剪短指甲，流水洗手三次。 操作阶段 1、 清理工作台面， 70%乙醇擦三次。 2、 70%乙醇擦手三次。 3、避免说话和来回走动 (二 ) 无性系建立 配制启动培养基 CK MS MS+6-BA 0. 5 mg/L + L MS+6-BA mg/L + L MS+6-BA 2. 0 mg/L + L MS+6-BA 1. 0 mg/L + L MS+6-BA 2. 0 mg/L + L 材料的选择 ：选用的枝条要求表面光滑、无病虫害。 培养步骤 ： （1）外植体消毒： 去杂→流水水洗 1～ 2h→ 70%乙醇（ 8-10s）→无菌水洗 3-5 次→ %HgCl2 10min）→无菌水水洗 5 次（2）接种： 用剪刀将灭菌后的枝条剪成 长约 1～1.5 cm 的单芽茎段。将茎段按其自然 极性方向垂直插入培养基，每瓶只接一个。对接种用具、超净台面、操作者手等 进行适当灭菌处理，继续接种。 （3）培养：培养物置于 25℃ 左右的培养室中，每天光照 12 小时，光照度 为 850-1200lx。 （4）观察：定期观察培养物的生长情况，及时将污染材料取出。 四、 作业 1、总结本实验外植体的消毒过程及关键步骤。 2、进行试验结果的观测、比较和记录，并通过分析筛选出月季无性系建立的最 佳培养基配方。 植物生长调节剂 No. 接种数/个 萌芽数 /个 污染数 /个 萌芽率 /% 芽生长情况 6-BA NAA IBA CK 0 0 1 2 1. 0 3 2. 0 4 1. 0 5 2. 0