RT-PCR数据分析[参考].pdfVIP

用 2-△△Ct 法分析 real-time PCR 数据 联合应用 LightCycler Data Analysis 软件和 MS Excel By netmee，netmee@163.com 引用请注明作者。 1、打开存取的数据文件，点击 2 、依次点击 ， ，这是适合 SYBR green 为染料的选项。点击 step1：Baseline 下的 “change graph settings ”小图标 。取消弹出的 Customize Graph 选项卡中的 Logarithmis 选项 ，点击 “OK ”按钮，退出选 项卡。 3、点击 下的 “change graph settings ”小图标 ，取消弹出的Customize Graph 选项卡中的 Logarithmis 选 项 ，点击 “OK ”按钮，退出选项卡。 4 、在 选项卡中拖动红色标记线，选取个条曲线都为直线上升部位。 5、可以在 选项卡中观察是否需选取的是曲线直线上升部分。观察绿线部分 与 S 型曲线交叉的部分是否为直线。 6、如果确为直线，则左侧的 “Crossing Point ”值为所需要的 Ct 值。 7、依次选取下图菜单：将数据导出为文本文件。 8、打开所保存的文本文件，如图选取 9、将数据粘贴入新建的 excel 文件，“Crossing Point ”列即是 Ct 值，删除 “Standard”和 “Calculated Concentration ”列。 10、将目的基因，本例中为 “iNOS ”的Ct 值按标本对应剪切入 beta-actin 值右侧一列。分 别标记两列数据为 “beta-actin ”和 “iNOS ”。 11、设置所有 Ct 值的单元格格式 12、数字选项卡，分类选择为数值，点击确定。 13、将E 列（目的基因 Ct 值右侧一列）输入公式 “=D4-C4 ”，求出目的基因与同管beta- actin Ct 值之差，即△Ct。 14、向下拉复制公式，将△Ct 列数值计算出。 15、在△Ct 列右侧一列插入公式 “=POWER(2,(0-E4)) ”，此即目的基因相对beta-actin 的相 对表达量，即 2-△Ct （2 的-△Ct 次方）。 16、在2-△Ct 列右侧插入公式 “=F4/$F$4”，此列即 “2-△△Ct”列，复制公式填满所有 标本对应的 2-△△Ct 空格。 17、至此，2-△△Ct 法计算的各标本目的基因的相对表达量完成，2-△△Ct 列的数据可以 用统计软件进行分析。