现代医学试验学-成骨细胞的培养和骨折模型的制作文档.pptVIP

成骨细胞的培养及骨折模型的制作 青岛大学医学院 阎春玲 ? 成骨细胞的培养可广泛应用于骨折及骨损 伤的疾病研究中，同时为筛选新型药物和 研究机制提供离体研究。 ? 原代培养 ? 细胞株 成骨细胞的培养及检测 原代培养 ? 成骨细胞的来源国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨 为成骨细胞的常用来源。 ? 有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明 所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学 活性及发生钙化的功能。 ? 有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖．代谢及钙化的能力发现 ，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸 酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可 以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石 (HA) 结晶。 小鼠原代培养 1. 取新生 3d 以内 BALB/c 小鼠，断颈处死后立即投入 75% 酒精 中消毒 5min 。 2.D- Hanks 液漂洗后分离颅盖骨，刮除骨膜和结缔组织， DMEM 清洗颅骨骨片并剪碎 3. 加入 0.25% 胰蛋白酶（含 0.02EDTA ）， 37 °恒温消化 20min ， 吸出消化液，之后 1mg/1mlI 型胶原酶 37 °恒温消化 20min 后离 心（ 1000r/min ， 5min ），弃上清液 4. 加入含 15% 血清的 DMEN 培养基，吹打骨片（力气不要过大， 但要吹打次数多一下，尽量使细胞从松解得骨片上脱落），将 细胞悬液接种于培养瓶中，置于 37 ℃ CO2 恒温孵育箱中培养 。 传代培养步骤 1. 弃除旧的培养液（可以吸，可以倒，倒的时候小心） 2. 用 PBS 冲洗一遍（加 PBS 清洗或换液时，不要将细胞冲刷下来） 3. 用 0.25% 的胰酶消化液消化 30-45s ，在显微镜下观察，细部变圆， 间距增大时，可用手拍打瓶侧壁与底壁，会发现细胞很快悬浮。 4. 加入含 15% 的牛血清培养液终止消化 5. 用吸管反复细心吹打瓶底，置离心管中后，可以用 PBS 或 D- HANKS 再吹打，可以反复几次，目的是将细胞尽可能的洗刷干净 6. 离心 大鼠成骨细胞的培养 ? 将 SD 乳鼠置入 75 % 酒精中浸泡 5min 。于超净 台 上取顶骨 , 放入 PBS 皿中 , 刮除附着组织 , 待骨质发 白、透亮 , 再放入 PBS 小瓶反复冲洗 , 换液 3 次 , 以 0.1 %II 型胶原酶消化 30min 后吸弃酶液 , 再以 PBS 冲洗 3 次 ，加入 0. 1 % II 型胶原酶 , 将骨剪成 1mm2 大小 , 放置 15min 后加入与酶液等量的含 15 % 小牛血清的 DMEM 培养基 , 吸取上清液 , 以 1 000r/ min 离心 10min , 将下层液接种于 50ml 培养瓶 , 离 心液去上清后接种于 25ml 培养瓶 , 分别加入上述 培养基 , 置入37 ℃、 5 %CO2 、饱和湿度培养箱内。 每 2 日换液 1 次 , 待细胞长满后 , 用 0. 25 % 胰蛋白 酶消化 , 按1∶2 比例传代。 ? 1. 成骨细胞的取材： 新生 SD 大鼠的乳鼠 新生 24h-72h 的乳鼠 ? 2. 将去除血管及结缔组织的骨片放置在 1mlPBS 液体中（ PBS 不要放太 多，否则延长剪碎时间），用剪刀剪成 1*1mm 的组织快，越小越好（ 越小越能消化完全），一只乳鼠的头盖骨加胰酶 2ml ，37℃水浴中消 化 30min （目的是消化掉附着骨片上的结缔组织），离心去酶，加入 2ml 胶原酶 2 ，水浴中继续消化 1h （中间间隔晃动，使消化下来的胶原 离开团块溶于液体中）。如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以加 适量的 PBS ，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到离 心管的底壁。 ? 3. 培养基问题：低糖的 DMEM 培养基 4. 培养瓶 培养瓶在接种前，使用 1% 多聚赖氨酸快速包被（具体方 法：每个 50ml 培养瓶加 3-4ml1% 多聚赖氨酸，尽量是底壁均铺满液体 ，拧上盖子，放置 30min ，倒掉 1% 多聚赖氨酸液体，用去离子水或 PBS 液冲洗两遍）， 包被的培养瓶，细胞很容易贴壁 。 注意问题 大鼠成骨细胞 成骨细胞的鉴定 形态学观察 碱性磷酸酶染色 (alkaline phosphatase ， ALP) 钙化结节染色 细胞株