动物固体组织蛋白提取-Protocol..docVIP

动物固体组织蛋白提取 -Protocol 动物固体组织蛋白提取 Protocol 1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入 75% 乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。 2、 裂解液配制： RIPA ：PMSF=100 ：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF ）。置入 4℃冰上。 3、抽蛋白（应冰上进行） ： a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般 10ml 管体系中加入： 7-8 粒磁珠、 100mg 组织、 1mlRIPA+10ulPMSF 、 1 tablet Cocktail 。 b、匀浆。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中， 再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器 皿中，右手将捣杆垂直插入套管中， 上下转动研磨数十次（ 6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织 匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用 40 安培， 5 秒 /次，间隙 10 秒反复 3～ 次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰， 溶解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右），但有部分酶活力会受影响。 c、将组织匀浆转入 1.5ml 的 EP 管中（eppendorf管、离心管）。12000r/min 4 °C 离心 15min 。 d、离心后 EP 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的 EP 管中。可 -80℃保存。 4、蛋白浓度测定。 a、配工作液：溶液 A ：溶液 B=50：1（200ul： 4ul）。 需测试复孔。 标本 X ，则需 A 量=2*（X+1+1 ） *200 ；B=2* （X+1+1 ）*4 。 WT LOS c、复孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlEP 管，再加入 54ulH 2O，混匀。即 10 倍稀释。 d、取 20-25ul 10 倍稀释蛋白样本加入 96 孔板平底板内，再加入 200ulAB 工作液，混匀振荡后， 37℃ incubate 30min 。 注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换 tip ，再加入工作液即起反应，应缩短时间。 e、酶标仪检测 562nm 吸光度。 Program f、计算蛋白浓度。 根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中 Y ： 蛋白浓度； X ：吸光度。 最终蛋白浓度为： 10*Y（ug/ul 、 mg/ml ） g、蛋白样本放 -80℃冻存。 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中， 化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化， 这一变化可由 分光光度计或 酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段， 每种都有其独特的优点。 如果样品数量较多， 可以同时使用两种测定用酶标仪自 动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素： 缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。 Commassie 法（ Bradford 法）： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料 G-250 结合，颜色从棕色变为蓝色，在 595nm 处检测吸光值然后与标准曲线对比， 即可计算出待测蛋白的浓度。 BCA 法： 原理：在碱性条件下，蛋白将 Cu++ 还原为 Cu+ ，Cu+ 与 BCA 试剂形成紫色络合物，测定其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 现对这两种方法进行比较： 一、实验材料： 细胞总蛋白提取试剂盒（ AR0103 ） M231 BCA 蛋白定量试 剂盒（ AR0146 ） Commassie 改良增强型蛋白质定量试剂盒 AR0145 ） 二、操作步骤： Commassie 法： 1.将 BSA 冻干标准品（10mg/支）用生理盐水 或 PBS 稀释成 2000ug/ml ， 1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml 八个浓度的蛋白标准溶液。 2.M231 用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。 3.各取 20ul 蛋白标准品和待测 M231 样品至相应标记的微孔板中。 4.滴加 200ul 考马斯