分子生物学课件 第6章 核酸分子杂交.pptVIP

一、固定支持物与印迹方法的选择 * * 1975年，Edwen Southern建立的DNA印迹： 印迹转移的方法有毛细作用转移、电转移和真空负压吸引转移 支持物 转移缓冲液 纸巾 玻璃板 500g Whatman滤纸 凝胶 Whatman滤纸 重物 NC膜或尼龙膜 * * 限制性内切酶消化 酶切DNA样品的电泳分离 凝胶中DNA的NaOH变性 凝胶中DNA分离带 Southern印迹 凝胶中DNA带被 转移到NC膜上 标记探针杂交 探针杂交带曝光显影 二、Southern印迹杂交的基本过程 ④HRP标记抗体与Dig结合 ②漂洗和封闭 Y HRP HRP HRP ⑤底物与抗体-HRP反应, 显色或发光 底物 ① 电泳,转膜，紫外交联固定 D │ │ D North-South 杂交原理和操作流程(地高辛标记) ③杂交：Dig标记的探针与靶DNA结合 * * 用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA或鲑鱼精子DNA预杂交。 思考题2 1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟； 2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。 化学发光检测 Luminol化学发光原理 * * North-South 杂交原理和操作流程(Biotin标记) ③杂交：生物素标记的探针与靶DNA结合 ⑤底物在HRP催化下,反应发光 ②洗膜封闭 ①电泳,转膜，紫外交联固定 SA HRP 底物 B │ │ B ④HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合 * * 第三节 Northern印迹杂交 利用类似于Southern印迹杂交的技术来检测RNA称为Northern印迹杂交（Northern blotting）。 原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。 * * Northern 与Southern blotting的异同点 相同点： 原理均为毛细作用 用途： 检测组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平； 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。 不同点： 转移的是RNA 转移前无需酶切 转移效率较高 变性方法: DNA(碱变性） RNA（甲醛、乙二醛等） * * * * * * * * 这种方法常用来从基因文库（gene bank或gene library）中来钓基因。 * * 核酸分子杂交 第六章 Nucleic acid hybridization * * * * 指含有一部分互补序列、分子来源不同的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷酸双链的过程。 核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 印迹(blotting) 指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成为固相化分子的过程。 * * 核酸杂交技术的理论基础：DNA变性复性现象。 第一节 核酸探针及其标记 核酸探针(probe)的概念： 用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的标记互补片段： 与待测特定核苷酸的某一段序列互补； 有明确的标志用于后续的检测。 * * * * 探针的种类 寡核苷酸探针 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 一 探针的种类及其选择 DNA探针 * * 1．基因组DNA探针 双链探针: 单链探针 采用PCR技术将各种克隆在质粒载体中的特异性基因片段扩增、标记制备而成。 用化学法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性基因片段制备。 * * 2．cDNA探针 提取mRNA，经反转录cDNA，再经cDNA克隆或PCR扩增、标记而制备成cDNA探针。 3．RNA探针 通常采用含T7或SP6启动子的表达载体来制备高度敏感的RNA探针。 * * 将目的基因克隆到含T7或SP6启动子的表达载体的MCS中，用适当的内切酶在插入序列的下游切割而成的线性载体作为模板，加入T7或SP6 RNA聚合酶、NTPs、和标记-dUTP,即可制备出高度敏感的RNA探针。 4．寡核苷酸探针 采用DNA合成仪人工合成、标记制备。 二 核酸标记物及其选择 　　核酸探针的标记可分为放射性标记和非放射性标记；根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。不影响碱基对特异性 理想标记物 应备条件 ①高度灵敏性 ④有较高的化学稳定性 ②高度特异性检且不影响与目标DNA结合 ③不影响标记用酶的活性 ⑤标记及检测方法简单 ⑥环保，无损害 * * 优点 缺点 灵敏度和特异性极高 半衰期短, 随