06第六章外源基因的表达【PPT】.pptVIP

第一节 基因表达机制 1.3 mRNA延伸和稳定性 转录启始后, RNA聚合酶延伸mRNA,至终止子处终止。 mRNA应在细胞中保持稳定的拷贝数：mRNA有半衰期，必须不停转录，才能保持稳定的拷贝数。 1.4 mRNA的加工 真核生物mRNA转录后需要剪切和拼接的加工过程。 基因转录、翻译的动画演示 真核生物基因转录、转录后加工及翻译过程 避免表达蛋白降解的方法: 采用融合蛋白表达系统 采用分泌蛋白表达系统 构建包涵体表达系统 选择无蛋白水解酶的受体。 基因沉默的形成机制主要有三种： 位置效应的基因沉默：整合入甲基化程度高、转录活性低的异染色体上，一般不表达。 转录水平的基因沉默：启动子的甲基化或外源基因的异染色质体。 转录后水平的基因沉默：RNA水平上, 基因可转录,但mRNA合成后被降解或被反义RNA或蛋白质封闭. 转基因植物和转基因动物中常见。 序列特异性：几个保守的序列框。 方向性：启动子正反两种方向中只有一种具有启动功能。 位置特性：启动子只能位于所基因的上游或基因内的前端。 种属特异性：不同种属、不同组织的启动子不同。 原核生物启动子 转录起始位点:多为CAT, 从第二个碱基开始。 -10区：TATAAT，一般在起始位点上游6bp处。 -35区：TTGACA，一般在起始位点上游35bp处。其中前个碱基高度保守 间隔区：-10区与-35区存在长度不等的间隔区，序列无保守性，间隔的长度非常重要。一般间隔16-18bp，E.coli.为17bp最好。 真核生物启动子 能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。 结构与启动子类似，由多个元件组成，每个元件与一种或多种转录调控因子结合。转录调控区通常有一至多个增强子。每个均有一种特定的功能：如在特定的发育阶段起作用。 转录终止的位置 分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。 ① 多数为单细胞, 异养，生长快，代谢易于控制，可迅速获得大量产物。 ② 基因组结构简单，便于操作。 ③ 含有质粒或噬菌体，便于构建表达载体。 ④ 生理代谢途径及基因表达调控比较清楚。 ⑤ 不具备蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。 ⑥ 内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。 大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。 应用最广泛的基因表达系统。 例如： 起始密码子与SD序列之间的距离：6～8bp，多数为7bp。 SD序列后面的碱基组成：为AAAA或UUUU时，翻译起始效率最高；为CCCC或GGGG是，翻译起始效率分别为最高的50%和15%。 小节 以包涵体形式表达的外源蛋白最突出的优点是： 易于分离纯化：包涵体的难溶于水，密度远大于其他蛋白，通过高速离心即可将包涵体蛋白与其他蛋白区分开来； 稳定性高：对蛋白酶表现出好的抗性。 ① 重组蛋白分泌到胞外 优点 E.coli.自身的胞外蛋白质少，利于重组蛋白的分离纯化，而且纯化时不需要经过细胞破碎。 E.coli.细胞外的蛋白酶活性很低，易于重组蛋白的稳定积累。 缺点： E.coli. 分泌蛋白的能力有限，产量较低。 纯化蛋白时的起始操作体积很大。 ②重组蛋白表达于细胞周质 周质中的蛋白质少，采用特殊的细胞破碎工艺可以减少宿主杂蛋白，利于重组蛋白的分离纯化。 周质中的蛋白酶活性低，利于重组蛋白的稳定。 周质具有一个氧化环境，利于重组蛋白正确折叠。 重组蛋白向周质转运时，信号肽在细胞内被切割，利于形成具有正确N末端的重组蛋白。 ③ 胞内 重组蛋白在胞内表达，通常以可溶性形式或不溶的包涵体形式存在。 可溶性形式表达： 缺点：胞内有较高的蛋白酶活性，重组蛋白不能稳定积累；胞内有大量的宿主杂蛋白，不利纯化。 解决方法：采用融合表达的方式生产重组蛋白，然后采用高分辨率的亲和层析进行分离。 包涵体形式表达： 特点： 优点：利于重组蛋白的分离纯化；不易被蛋白酶降解。重组蛋白折叠错误，不具有生物活性，不会对宿主细胞造成毒害。可直接作为抗原制备抗体。 缺点：要想得到具有生物活性的重组蛋白需要经过繁琐的变性、复性过程且得率不高。 通常采用低温诱导、与分子伴侣共表达等方式避免包涵体的形成，以提高有活性的重组蛋白的得率。 ① 机械破碎法 包括研磨法、匀浆法、捣碎法等。 ② 物理破碎法 包括反复冻融法、溶胀法、压榨法、超声波破碎法等。 ③ 化学破碎法 使用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性有机溶剂或SDS等表面活性剂处理细胞。 也可与研磨法联合使用将细胞膜溶解从而使细胞破裂。 ④ 酶促破碎法 包括自溶法和酶溶法。 4.6.3 细胞破碎后的固液分离 高速离心：实现固液分离，将细胞碎片和其它固形物沉淀下来。 对于可溶性表达的重组蛋白：可溶于上清液中，直接进行后续纯化。 包涵体：与细胞