生精细胞凋亡及其可能的信号通路.docVIP

PAGE / NUMPAGES 生精细胞凋亡及其相关内容 细胞凋亡又叫程序性细胞死亡,是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡的过程。细胞凋亡过程是受基因的精确调控而完成的,其具体的过程机制尚不明确,Bcl-2 是一种细胞膜蛋白,主要存在于线粒体膜、滑面内质网和核膜上,高水平的 Bcl-2 蛋白有抑制细胞死亡等作用,是细胞凋亡调控机制中的一个关键蛋白。Tanaka等证实 Bcl-2 能抑制睾丸生精细胞的凋亡和分化。CytC 是一个线粒体起源的细胞凋亡信号,Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质,而Bax、Bak可与Bcl-2结合,止其对CytC释放孔道的抑制作用,从而促进CytC从线粒体释放,引起凋亡。CytC通过接头分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化,进而诱导细胞凋亡。caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶,是凋亡执行的重要效应分子。正常情况下,caspase-3以酶原的形式存在于细胞质中,无活性,当细胞接受凋亡刺激时,其被激活,而诱导凋亡。caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。 检测生精细胞凋亡的技术 4．1 形态学检测 透射电镜检测：处死大鼠,取出睾丸。取出左侧睾丸少量组织,迅速在冰浴上切成1mm×1mm×2mm小块,置于预冷的2%戊二醛溶液中固定,标本经锇酸固定、脱水、树脂包埋、超薄切片和醋酸双氧铀染色后,在透射电镜下观察。可见细胞质空泡化,核膜增厚,核周隙增宽；染色质浓缩,附着于核边缘呈新月形；严重者染色质固缩、断裂, 出现凋亡小体。 4．2 琼脂糖凝胶电泳 通过观察 DNA梯状电泳带或定量检测DNA片段,可测定凋亡。凋亡细胞 DNA 在核小体连接处规律性降解,形成以180 bp一200 bp为最小单位的寡聚体片段,琼脂糖凝胶电泳时呈典型的“梯状带”。但Singh等琼脂糖凝胶电泳检测到青年人生精细胞DNA迁移呈圆形,老年人凋亡生精细胞DNA迁移呈彗星状 。 4．3 DNA缺口原位标记法 处死大鼠,取出睾丸。置于10%中性福尔马林溶液中固定24ｈ,常规石蜡包埋、切片（4μm）,用于原位末端标记法（TUNEL）检测。主要以精原细胞凋亡为主。可见曲细精小管中各级生精细胞大量凋亡,管腔变薄,管腔中可见大量凋亡的分裂晚期的精子细胞。DNA缺口原位标记(TUNEL)法可用于检测凋亡细胞。此方法是将细胞的外源性核苷酸 (dUTP)结合到单股断链的3′粘性未端上,标记的DNA 再用荧光或显色法检出。该法可检测早期细胞凋亡,特异性和敏感性都很高。E renpreisa等用甲苯胺蓝(tolui di ne blue,TB)、吖啶橙 (acridine orange,A0)和TUNEL法检测人生精细胞 DNA的完整性,证实这3种方法具有一致性。 4．4 流式细胞术 流式细胞 (flow cytometry, FCM)可进DNA 、RNA含量分析,细胞周期、细胞表面标志和细胞受体分析。凋亡细胞的DNA裂解,FCM的DNA图上呈亚二倍体核型峰特点。应用DNA 染色剂穿透正常和凋亡细胞膜的能力,及其与凋亡细胞DNA 结合能力不同以区分正常细胞、凋亡细胞。FCM 还可定量检测凋亡标记蛋白的表达。吞噬凋亡细胞和未吞噬凋亡细胞的巨噬细胞群可利用带有荧光染料反应物的FCM 区分。 4． 5 免疫组化法 利用抗原抗体特异性结合测定凋亡相关物质以检测凋亡。凋亡蛋白抗体或抗单链 DNA 抗体标记观察凋亡细胞可检测凋亡标记蛋白Fas／FasL、Bc1-2／Bax、p53、p2l、caspases等以鉴定细胞凋亡。 死亡受体途径 Fas/FasL系统：现已有多种证据表明Fas/FasL信号系统启动生精细胞的凋亡：①在混合培养的支持细胞和生精细胞中加入FasL的反义核苷酸(阻断FasL的翻译), 能明显观察到生精细胞凋亡数目的减少；②Fas和Fas L的mRNA表达量随动物年龄的不同而不同。大鼠在16~ 33 d最多, 此时刚好是大鼠生精细胞凋亡的高峰期；③加入模拟 FasL效用的 Fas激动剂Jo-2(一种抗 Fas的抗体), 生精细胞的数目大大减少；④在环境内分泌干扰物邻苯二甲酸-2-乙基已基酯(DEHP)的代谢产物邻苯二甲酸-单-乙基已基酯(MEHP)等一些有害化合物引起的睾丸损伤中, 随着生精细胞凋亡数目的增多, Fas和 FasL的表达量也相应提高并逐渐达到峰值。 Bcl一 2 家族成员引发的线粒体途径 在细胞凋亡中, 死亡信号通过 Bcl-2 家族或直接诱导线粒体膜通透性增加, 释放细胞色素c ( Cyt c) , 激活半胱氨酸蛋白酶, 继而使细胞发生凋亡。 Bcl-2 家族的凋亡前体成员,一组BH3亚蛋白家族引发线粒体途径。胞外因素促使这些