石蜡切片免疫组化与免疫荧光染色方法模板计划总结计划模板计划模板.doc

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织的采集、固定和保存： 采取组织后， 方法一： 4%多聚甲醛（ 4%PFA ） 4 C 固定 1 小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜 方法二：采用  bouin’ s 固定  RT 2h（ 6-8d tesis） or RT  过夜（成年  tesis） PBS 缓冲液洗三次，每次  5min ， 4 C 保存于  70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存： ： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明， 52-54 C 石蜡包埋，常规切片，切片厚 4 -10 m，贴于处理过的干净载玻片上， 37 C 烤片过夜，之后收集于载片盒中， RT 密封保 存。 石蜡包埋： 保存于  4 C 70%乙醇中的组织样品 80%乙醇  15 min 95% 乙醇 15 min 100%乙醇 15min 2 1/2 乙醇 1/2 二甲苯 15 min 二甲苯透明 5-10 min 1/2 二甲苯 1/2 石蜡 30 min 石蜡（ 1） 1.5hr 石蜡（ 2） 1.5-2.5hr 石蜡（ 3） 包埋 RT 保存 3、石蜡组织切片的免疫组化方法： 密封保存于 RT 的组织切片 二甲苯 (1) 20 min 二甲苯 (2) 20 min 100%乙醇 20min 95%乙醇 10 min 80%乙醇 10 min 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 切片在 PBS 中浸泡 5 min*2 0.4%Tritonx RT 10 min 切片在 PBS 中浸泡 5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在 PBS 中浸泡 5 min*3 0.25% 胰酶 RT 10min 切片在 PBS 中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 倾去 blocking buffer ，勿洗 一抗 4 C overnight in blocking buffer 取出切片复温 1h，切片在 PBS 中浸泡 5 min*3 二抗 in blocking buffer GAR1 ： 200 （ GAM1： 100）， RT 1h 切片在 PBS 中浸泡 5 min*3 DAB 显色 5-10min（ 50 微升 A+50 微升 B+900 微升 PBS+5 微升 3%H2O2 ） 如果是增强型 DAB 只要 1min 即可。 切片浸入 PBS 终止显色， HE 衬染 1s， 玻片架放入泡沫盒， 流水冲洗 15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。 若颜色太深，可用 0.1-0.5% 盐酸乙醇分色 1～ 2 秒钟（或更久） 脱水 85% 乙醇 5 min 95%乙醇 5 min 无水乙醇 5 min 无水乙醇 5min 二甲苯 (1) 10min 二甲苯 (2) 10min 中性树胶封片，室温干燥保存 4、石蜡组织切片的免疫荧光方法： 密封保存于 RT 的组织切片 二甲苯 (1) 20 min 二甲苯 (2) 20 min 100%乙醇 20min 95%乙醇 10 min 80%乙醇 10 min 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 切片在 PBS 中浸泡 5 min*2 0.4%Tritonx RT 10 min 切片在 PBS 中浸泡 5 min*3 切片在  PBS 中浸泡  5 min*3 0.25%  胰酶  RT 10min 切片在  PBS 中浸泡  5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) 倾去 blocking buffer ，勿洗  RT 60min 一抗 4 C overnight in blocking buffer 取出切片复温 1h，切片在 PBS 中浸泡 5 min*3 荧光二抗 in blocking buffer GAR-cy3 1： 1000， GAM-4881： 1000RT 1h DAPI （ 1：1000 请根据二抗说明稀释二抗） 切片在  PBS 中浸泡  5 min*3 moil  封片，避光  4 C 保存