西北农林科技大学 生物技术综合大实验.docVIP

西北农林科技大学 生物技术综合大实验 生物技术综合大实验——原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷（2012014069） 纪成功 孔令浩 王玉康 王鹏程 董奉新 （西北农林科技大学） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。 关键词：GFP 蛋白提纯 疏水层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 1. 介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发 现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β 圆柱，圆柱两端由一些较短的α 螺旋盖住，圆柱中央是几段α 螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。 2. 材料和方法 2.1. pGFP质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于1.5ml离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm离心3min，转移上清于另一新1.5ml离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μl TE中溶解，冰上暂存。 2.2. 转化 取1.5ml OD600 0.3~0.4 BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl 0.1M CaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl 0.1M CaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μl LB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。 2.3. 筛选重组子及扩大培养 将平板放置紫外灯下检测，标记，挑取绿色荧光单菌落，于5mlLB（amp）培养基中37°C、150rpm震荡培养7小时——吸取2ml菌液，置于200mlLB（amp/ara）培养基中，37°C、150rpm振荡培养过夜。本组的平板并无可视菌落，所以挑去他组菌落 2.4. 收菌破碎 收集菌液200ml于250ml离心管，共4管，5000xg离心10min，弃上清——每管30ml溶解缓冲液（50mM Tris-HCl，1mmol/L EDTA）重悬沉淀，将4管合并为1管——每管加入60μl溶菌酶，混匀 将离心管置于冰上，超声波破碎仪探头插入离心管，探头离底部约1cm且不触离心管壁——900w，超声3s，静止3s，共8min，重复3次——7500xg离心15min，在紫外灯下观察沉淀（留样）和上清（留样），取上清备用。 2.5. 盐析 取上清定容至80ml——取10ml做预实验——用溶解缓冲液稀释至100ml——分装至10只试管，每管10ml——称取不同浓度梯度(NH4)2SO4（见下表），室温静置15min——各取1ml于1.5ml离心管，7500rpm离心15min——在紫外灯下观察GFP沉淀情况，可看出，第五管（(NH4)2SO4含量50%）时出现沉淀（杂蛋白），第八管（(NH4)2SO4含量80%）沉淀量最大（GFP）——在剩余70ml上清中加入20.37g(NH4)2SO4（含量50%），室温静置30min——7500rpm离心15min，取上清——加入36.12 g(NH4)2SO4（含量80%），室温静置15min——7500rpm离心15min，弃上清，-20°C保存。 (NH4)2SO10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 4（%） (NH4)2SO0.70 1.06 1.64 2.26 2.9