【代码M0907】转化子的筛选与库质粒纯化.docxVIP

【代码M0907】转化子的筛选与库质粒纯化 2015-10-14实验管家 实验管家 一.?培养基： 二.?实验步骤： 1.?选择菌落数?30-300?的滴度平板计算转化效率与克隆总数： 假设?100ug?库质粒转化时重悬菌液?10ml,?以?100ul?菌液涂布的?1:100?的滴度板上菌落数?100，则： 2.?筛库要求克隆总数超过文库克隆数（胎肝库为1.6×106?克隆）的十倍；若克隆总数低于?106?则需重新转化; 3.?将平板移至?4°C?冰箱，固化琼脂?3-4?小时; 4.?超净台中，向每块平板滴加?5ml 1×TE，用涂布棒刮下菌落，收集于50ml?离心管; 5.?室温离心?2500rpm×5min，弃上清。用无菌双蒸水反复洗涤?3-5?次; 6.?保存菌种：每管取?0.5ml?菌液与?0.5ml 65%甘油?硫酸镁混匀，-70°C?冻存; 7.?取适量菌液（使克隆总数达文库滴度的5-10?倍），涂布?SD/ -Trp-Leu-His-Ade?筛选平板，30°C?倒置培养?3-5?天至菌落出现; 8.?挑取菌落点种到?SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL?平板，30°C?倒置温育，显兰色的菌落即阳性候选克隆; 9.?阳性候选克隆分区划线接种于?SD/-Trp-Leu /X-α-GAL?平板上，30°C?倒置温育?3天，使同一酵母菌中几种库