Western Blot（中农大汪亚中）.docxVIP

Western Blot 1、植物总蛋白的提取 （1）取适量玉米幼胚材料在液氮中迅速研磨成粉末，取0.5ml粉末于2ml离心管中，加入500ul蛋白提取裂解液（附录1）,立即涡旋震荡混匀，冰上放置30min，期间时常晃动； （2）13000rpm，4°C，离心15min，取上清，再次离心15min,取上清。 2、植物总蛋白浓度检测 （1）测蛋白所需的Buffer（Bio-Rad Protein Assay,货号：#500-0006）稀释五倍； （2）每个酶标板孔里加入200ul的蛋白Buffer； （3）0.1%的BSA作标准曲线:在酶标板的第一列8个孔中分别加入0、1、2、3、4、5、6、7ul的0.1%BSA，吹打混匀； （4）分别取1ul、2ul的每个待测蛋白样品于酶标板孔中，吹打混匀； （5）酶标仪测蛋白浓度，取两次测样平均浓度。 Western Blot检测 （1）提取出的蛋白测浓度，将蛋白定量到40μg上样，加入4μl 6×Protein Loading Buffer,蛋白提取裂解液定容到24μl； (2)煮沸10min，冰浴2min，快速离心； (3)吸取20μl上样，SDS胶的浓度取决于蛋白分子量的大小，蛋白分子量越大SDS胶的浓度越低（附录2）。上样顺序依次为：marker，负对照→待检测样品→正对照； (4)电泳，U=80V，15min，后转为200V，30min； (5)转膜（所用为PVDF膜） 膜大小：8×6cm(长×宽)；4张滤纸，稍大于膜； 膜正面右下角做标记，使用前先在甲醇中浸泡10s以上，活化膜； 转膜夹的放置顺序，从下至上依次为：黑色板→海绵→滤纸2层→胶（右至左）→膜→滤纸2层→海绵→白色板； 转膜条件：U=100V，转膜1h； 转膜过程保持在低温中进行，转膜缓冲液提前在4℃冰箱预冷，在转膜电泳槽内放一个冰袋，冰浴转膜； （如果是随后做Western Blot，将转移完成的膜置于甲醇中浸泡几秒，取出膜晾干，用保鲜膜包起来以免弄脏膜） （6）将晾干的膜用甲醇浸泡一下，TBST溶液清洗3分钟，转速200rpm； （7）抗体孵育 一抗孵育：自制的多克隆抗体按适当的效价比稀释（本实验尝试过1:250,1:500,1:1000的效价比，确定最佳效价比为1:1000）于适量的5%脱脂牛奶溶液（1x的TBST溶解）中，室温下于80rpm摇床上孵育1h； TBST清洗：15min1次，5min2次，于200rpm摇床上； 二抗孵育：GAR抗体按1:5000效价比稀释于适量的5%脱脂牛奶溶液（1x的TBST溶解）中，室温下于80rpm摇床上孵育1h； 清洗：15min1次，5min4次，于200rpm摇床上； （8）显影 显影底物ECL溶液A与B，使用前按1:1混匀，一般半张膜是600μl（300：300μl）显影底物，一张膜是1000μl（500:500μl）显影底物； 将膜与显影底物充分结合后，正放于X射线摄影暗匣上，黑暗或红光条件下取胶片于暗匣中曝光，一般是先曝光2min，看一下条带，再根据信号强弱调整压片的时间。胶片曝光后置于显影液中显影1min(时间视显影效果适当调整)，清水冲洗下，在定影液中定影1min,清水洗干净片子，晾干，标记Marker的位置。 注：1.做完Western Blot的蛋白重新冻于-80℃冰箱； 2.若是没有显出任何条带，尤其是正对照，则可能是抗体有问题，或者是ECL过期不能用了。这种情况下先用TBST清洗膜6分钟，摇床转速200rpm，之后重新显影。如果还是没有条带则可能是抗体有问题，用0.1M Glycine buffer(水溶)洗3min，摇床转速80rpm，再用TBST洗15min，摇床转速80rpm，之后重新进行抗体孵育。 相关溶液： （1）Tris-甘氨酸电泳缓冲液（1x）：800mlddH2O溶解0.2g SDS+3.02g Tris+14.4g甘氨酸后,ddH2O定容到1L； （2）转膜缓冲液：750ml ddH2O溶解3.03g Tris-Base+14.4g甘氨酸，加入200ml甲醇，ddH2O定容至1L； (3)10x TBS溶液:88gNaCl+12.12gTris-base溶解于800mlddH2O中,浓盐酸调PH至8.0，定容至1L； （4）1x TBST溶液：100ml的10x TBS溶液+0.5mlTWEEN-20,定容至1L； （5）抗体孵育封闭液（5%脱脂牛奶）：5g奶粉溶解于100ml TBST溶液。 附录1 玉米胚蛋白提取液 (10 mL) 成分 母液浓度 用量 25mM Tris-Hcl(PH=7.6) 1M(PH=7.6)