微生物限度方法总结计划学验证.docx

微生物限度检查 方法学验证 一、检验方法 依据微生物计数法 （中国药典 2015 年版四部 1105）；控制菌检查法（中国药典 2015 年版四部 1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典 2015 年版四部 1107）；抑菌效力检查法（中国药典 2015 年版四部 1121）检查。二、菌种、培养基及稀释液 表1菌种 菌种名称 菌种代数 菌种状态 厂家 大肠埃希菌 [CMCC(B)44102] 3 正常 金黄色葡萄球菌 3 正常 [CMCC(B)26003] 枯草芽孢杆菌 3 正常 浙江省食品药 [CMCC(B)63501] 白色念珠菌 [CMCC(F)98001] 3 正常 品检验研究院 黑曲霉 [CMCC(F)98003] 3 正常 乙型副伤寒沙门菌 3 正常 [CMCC(B)50094] 表2培养基 培养基名称 批号 厂家 营养肉汤培养基 150222 北京三药科技开发公司 改良马丁培养基 150134 北京三药科技开发公司 改良马丁琼脂培养基 150215 北京三药科技开发公司 营养琼脂培养基 150317 北京三药科技开发公司 玫瑰红钠琼脂培养基 150323 北京三药科技开发公司 胆盐乳糖培养基 150127 北京三药科技开发公司 胆盐硫乳琼脂培养基 150214 北京三药科技开发公司 四硫磺酸钠亮绿培养基 150416 北京三药科技开发公司 MUG培养基 150122 北京三药科技开发公司 曙红亚甲蓝琼脂培养基 150137 北京三药科技开发公司 三糖铁琼脂培养基 150207 北京三药科技开发公司 表 3 对照用培养基 对照培养基名称 批号 厂家 营养肉汤对照培养基 中国食品药品检定研究院 营养琼脂对照培养基 中国食品药品检定研究院 玫瑰红钠琼脂对照培养基 中国食品药品检定研究院 胆盐乳糖对照培养基 中国食品药品检定研究院 胆盐硫乳琼脂对照培养基 中国食品药品检定研究院 四硫磺酸钠亮绿对照培养基 中国食品药品检定研究院 MUG对照培养基 中国食品药品检定研究院 曙红亚甲蓝琼脂对照培养基 中国食品药品检定研究院 三糖铁琼脂对照培养基 表4试剂 试剂名称 批号 级别 磷酸二氢钾 130826 分析纯 氢氧化钠 分析纯 氯化钠 分析纯 聚山梨酯 80 化学纯 95%乙醇 药用级 二甲氨基苯甲醛 分析纯 盐酸 分析纯 稀释液： （ 1）缓冲液 取L磷酸二氢钾溶液 250ml, 加L氢氧化钠溶液 118ml, 用水稀释至 1000ml，摇匀，既得。 （ 2）%无菌氯化钠溶液 取氯化钠，加水溶解使成 1000ml，过滤，分装、灭菌。 （ 3）％（ ml/ml ）聚山梨酯 80 的%无菌氯化钠溶液 取聚山梨酯 80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至 1000ml，滤过，分装，灭菌， 备用。 （ 4）靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛，加入 95%乙醇 95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸 20ml 徐徐滴入。 三、菌液的制备 细菌、霉菌、酵母菌 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基 中，培养 24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养 48 小时。 上述培养物用 %无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50～ 100cfu 的菌悬液备用。 接种黑 曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养 7 天，加入 5ml 含％（ ml/ml ） 聚山梨酯 80 的%无菌氯化钠溶液 , 将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管） 用%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数 50～100cfu 的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用，若保存在 2～8℃可在 24 小时内使用。 控制菌 接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培 养基中，培养 24 小时。用 %无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 10～ 100cfu 的菌悬液。 菌悬液在室温下放置应在 2 小时内使用，若保存在 2～8℃可在 24 小时内使用。 四、验证内容 1、计数方法验证 将制备好的菌悬液用 %无菌氯化钠溶液以每 10 倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数，确定具体菌悬液浓度，取接近于 10cfu-100cfu 的稀释浓度，选取各项试验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。 经过验证当原液稀释至 10-6 时，菌液浓度接近 100cfu/ml 。 2、适用性检查 细菌、霉菌、酵母菌 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各  1ml( 内含菌约  50～ 100cfu)  ，分 别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备  2 个平皿，混匀， 凝固，置