202014碱性磷酸酶米氏常数的测定.ppt

实验十四 碱性磷酸酶米氏 常数的测定 一、目的要求 1. 学习分光光度法测定的原理和方法 2. 学习和掌握米氏常数（ K m ）及最大反应速度 （ V m ）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的 K m 和 V m 值。 二、原理 酶促反应 v -[S] 曲线 v [S] 推导出米氏方程为： 其中 [S] 为底物浓度； v 为初速度； V m 为最大反应速度； K m 为米氏常数 ] [ ] [ S K S V v m m ? ? 米氏常数 K m 是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数 K m 往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定 K m 和 V m ，可通过作图法求得。 最常用的 Lineweaver-Burk 双倒数作图法。这个方法是将米 氏方程转化为倒数形式，即 ： 以 1/ v 对 1/[S] 作图，可得一条直线 m m m V S V K v 1 ] [ 1 1 ? ? ? 1/ v 1/ V m -1/ K m 1/[S] ? 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐 (pNPP) 水解的 K m 和 V m. ? 反应式： pNPP+H 2 O pNP+HPO 4 2- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物 pNP 的含量，求出反应速度 v 。 三、试剂与器材 试剂： 0.5 ? mol/mL pNP 、 10 mmol/L pNPP 、 20 mmol/L MgCl 2 、 0.1 mol/L 碳酸钠 — 碳酸氢钠 pH 10.1 缓冲液、 0.2 mol/L NaOH 、 6 ? g/mL 碱性磷酸 酶酶液 器材：恒温水浴锅、 722 分光光度计 四、操作方法 （ 一）对硝基苯酚标准曲线的制作（ 不做 ） 取 5 支试管编号 ,0 号一支 ,1 － 7 号各二支 , 按下表操作： 管 号 0 1 2 3 4 5 6 pNP 含量 ( ? mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5 ? mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H 2 O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Na 2 CO 3 -NaHCO 3 (mL) 各管加入 1.0 mL 20 mmol/L MgCl 2 (mL) 各管加入 0.2 mL 0.2 mol/L NaOH (mL) 各管加入 2.0 mL OD 405 nm ? 以对硝基苯酚的绝对量 ( ? mol 数 ) 为横坐标， OD 405nm 值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出 pNP 的克分子消光系数 ( ? ) 值。 ( 二）测定 15 支试管， 1-5 做两组平行测定管， 01-05 作为空白对照 。 No.