2020实验四还原糖蛋白质脂肪的鉴定.ppt

【实验四】生物组织中 还原糖、脂肪、蛋白质 的鉴定 1 ．实验目的 ? 1 学会本实验的准备 ? 2 练习并熟练掌握鉴定生物组织中可溶 性糖、脂肪、蛋白质的基本方法。 ? 3 学会教学生进行实验探究。 ? 4 弄清实验过程中应注意事项，易出现 的问题及解决方法。 实验原理： ? 某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机 化合物产生特定的颜色反应 ? 如：糖中的还原糖与斐林试剂发生作用可以 生成砖红色沉淀；蛋白质与双缩脲试剂发生 作用产生紫色反应；脂肪可以被苏丹Ⅲ染液 染成橘黄色。 ? 因此，可以根据与某些化学试剂所产生的颜 色反应来鉴定生物组织中糖、蛋白质和脂肪 的存在 ? 还原糖的鉴定原理 生物组织中普遍存在的还原糖种类较多，常见的有 葡萄糖、果糖、麦芽糖。它们的分子内都含有还原性基团（游离醛基 或游离酮基），因此叫做还原糖。蔗糖的分子内没有游离的半缩醛羟 基，因此叫做非还原性糖，不具有还原性。本实验中，用斐林试剂只 能检验生物组织中还原糖存在与否，而不能鉴定非还原性糖。 ? 斐林试剂由质量浓度为 0.1 g ／ mL 的氢氧化钠溶液和质量浓度为 0.05 g ／ mL 的硫酸铜溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的 Cu(OH)2 沉淀。 Cu(OH)2 与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成 砖红色的 Cu2O 沉淀，而葡萄糖本身则氧化成葡萄糖酸。其反应式如下： ? CH2OH — (CHOH)4 — CHO ＋ 2Cu(OH)2→CH2OH — (CHOH)4 — COOH ＋ Cu2O↓ ＋ 2H2O ? 用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色棕色砖红 色 ( 沉淀 ) 。 ? 鉴定可溶性还原性糖的另一种方法：多伦试剂法。多伦试剂即硝酸银 氨水溶液，配制方法：取 0.3ml2 ％硝酸银溶液，滴入 10 ％氢氧化钠溶 液，再滴入 2 ％氨水溶液，边滴边摇动试管，直到生成的沉淀恰好溶 解，即得到澄清的硝酸银氨水溶液。现用现配。 ? 蛋白质的鉴定原理 鉴定生物组织中是否含有 蛋白质时，常用双缩脲法，使用的是双缩脲 试剂。双缩脲试剂的成分是质量浓度为 0.1 g ／ mL 的氢氧化钠溶液和质量浓度为 0.01 g ／ mL 的硫酸铜溶液。在碱性溶液 (NaOH) 中， 双缩脲 (H2NOC — NH — CONH2) 能与 Cu2+ 作 用，形成紫色或紫红色的络合物，这个反应 叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很 多与双缩脲结构相似的肽键，因此，蛋白质 可与双缩脲试剂发生颜色反应。 供选材料 ： ? l 可溶性还原性糖的鉴定：苹果含果糖较高，实 验效果也很明显，且容易在市场上买到。但要注意， 苹果组织液必须临时制备，切勿保存时间过长。因为 苹果多酚氧化酶含量较高，组织液很容易被氧化成褐 色，将反应产生的颜色覆盖。温度高时，氧化的速度 更快。而梨和白心萝卜的组织液不会有这种现象出现。 ? l 蛋白质的鉴定：鸡蛋清：蒸馏水 =1:9 混合均匀， 再用 4 层纱布过虑，放入滴瓶中备用，这样配制的蛋 清溶液与双缩脲试剂反应后不会粘固在试管内壁上， 反应也彻底，试管也容易洗刷干净。 ? 也可以用浓豆浆代替蛋清溶液 器材 ? 显微镜、双面刀片、试管、试管夹、大 烧杯、酒精灯、三脚架、石棉网、试管 架、载玻片、吸水纸、电炉。 试剂配制： ? 斐林试剂 ? 甲液 氢氧化钠的质量浓度 0.1g/ml 的溶液 ? 乙液 硫酸铜的质量浓度 0.05g/ml 的溶液 ? 使用时临时配制，将 4 滴～ 5 滴乙液滴入 2ml 甲液中，配完立即使用。 ? 与斐林试剂原理一样的本尼迪试剂配制后可长久保存，配方如下：无水硫酸铜 1.74g 溶于 100ml 热水中冷却后加至 150ml 。取柠檬酸钠 173g ，无水碳酸钠 100g 和 600ml 水共热，溶 解后冷却并加水至 850ml 。再将冷却的 150ml 硫酸铜溶液倾入即可。 ? 苏丹 III 溶液的配制 ? 称取 0.1g 苏丹 III 或 IV 干粉，溶于 50ml 丙酮中，再加入 70 ％酒精 50ml 即可使用。 ? 苏丹Ⅳ溶液的配制 称取 0.1 g 苏丹Ⅳ干粉，溶于 50 mL 丙酮中，再加入体积分数为 70% 的 酒精 50 mL ，充分混合后即可使用。 ? 双缩脲试剂的配制： ? 取 10g 氢氧化钠放入量筒中，加水至 100ml ，待充分溶解后倒入试剂瓶中，配成氢氧化钠的 质量浓度为 0.1g/ml 的溶液