流式细胞术样本制备.docxVIP

样本制备实例 : 细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining 原理 : 对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色 (DIF 和间接染色 (IIF 两种。直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色 ;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合 , 然后 再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。荧光染色的方法 在蛋白质检测 中使用非常普遍 ,因为只要采用合适的抗体 ,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。 但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同 ,以及临近通道串色的问题 , 多色实验的基本原则是 :最强的染料配表达最弱的蛋白 ,最弱的染料配表达最强的蛋白 ; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通 道。还需要考虑染料之间的溢漏、以及 偶联染料已降解的问题。现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605 等为多 色实验提供了更多的选择空间。 材料 : ?被检测细胞 ?FACS Lysing Solution ( 细胞裂解液 , 1 倍或 10 倍, 10 倍的要先稀释到 1 倍后使 用 ?相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC 步骤 : 在 100 Lμ外周血加入抗体 : a. 同型对照 :PB 100 μL +Isotope FITC 20 L+Isoto