基因工程载体人工染色体载体ppt演示课件.ppt

3. Binary vector T-DNA does not need to be physically attached to the rest of the Ti plasmid Use separate plasmids to supply the disarmed T-DNA and the virulence functions The small plasmid can be used to inserted foreign gene When the two plasmids present together in the same A.tumefaciens cell, the T-DNA carried by pBI121 is transferred to the plant chromosomal DNA by proteins coded by genes carried by pAL4404 Ti质粒及其衍生载体 Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体： （1）双元载体(binary vectors） 如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记 （2）共整合载体(integrated vectors) （1）双元载体系统（binary vector） 具有两个质粒——穿梭质粒和Ti质粒。 （2）共整合载体（integrated vector） 共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成区经过突变后的Ti质粒和中间载体两部分。 Ti质粒的衍生载体 发根农杆菌存在另一种质粒，Ri质粒。 Ri质粒也可完成外源基因向植物的转移工作。 发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根或发根，Ri质粒为根诱导质粒。 Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部分。 Ri质粒 T区与Ti质粒的T-DNA十分相似： ①T区的左右边界序列。左右边界上含有25bp的重复序列。 ②TL-DNA区。该区中含有与毛状根形成有关的rolA、B、C、D基因群。 ③TR-DNA区。该区中含有与农杆碱合成有关的基因（ags）和生长素合成有关的基因（tms1、 tms2）。ags基因在转化的初期起着重要的作用，是不定根产生的关键 Ri质粒 CaMV克隆载体 含1个约8kb的环状双链DNA分子； 用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移； 其感染对植物有害，不能直接做载体； CaMV的DNA在植物细胞中能高水平转录35S RNA，其启动子是一强启动子。构建的含35S启动子的系列克隆载体可在植物细胞内高效表达基因。 三、动物载体 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。 　　 猴病毒40（SV40）的基因组常用来作为克隆载体，把外源DNA转入哺乳类细胞。猴病毒40是球形动物病毒，直径40nm，呈20面体，有一个共价闭环的双链DNA基因组，全长5244bp。它在猴肾中增殖。被SV40感染的细胞都会出现SV40的T抗原。早已证明完整的小鼠染色体β珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整合在SV40中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠β珠蛋白的初级转录本。 Cloning vectors of animal cell 动物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物 5243 bp共价闭合环状分子 感染率高，几乎100％寄主细胞能被感染 能提供完整的真核基因转录所需的成分  侵染性具有寄主特异性 改建：野生型最多只能包装其基因组长度的1.05倍的 DNA分子 其他：痘苗病毒DNA作载体，表达乙肝表面抗原 用家蚕的核多角体病毒表达人α-干扰素 第三节 其他载体 2012.09