植物组织培养 技能训练 原生质体的分离培养与细胞培养--原生质体的融合.pptxVIP

原生质体培养与体细胞杂交 ——原生质体融合方法;定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。;一、原生质体融合意义; １９６０年英国生物学家科金发明了用酶脱除细胞壁的方法，给植物细胞融合技术扫清了第一道障碍。 在许多研究人员成功地进行了不同植物的细胞融合，并培养出了再生植株后，许多人开始尝试培育不同种属的超级杂交植物。 １９７８年，德国的梅罗帕斯博士用细胞融合的方法培育出了马铃薯（土豆）和番茄的杂交后代———薯番茄。 先用酶液除去马铃薯、番茄的细胞壁，然后将两种去壁细胞（原生质体）等量混合，在混合液中加进聚乙二醇溶液，使原生质体紧密粘聚，再用高钙和高ｐＨ溶液处理，结果，马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高达４０％～５０％。他们也曾进行过有性杂交的实验，但都失败了。 ;;二、植物体细胞杂交的主要程序： 原生质体的制备 原生质体融合 杂种细胞的选择 杂种细胞的培养 杂种植株的鉴定;融合过程;三、融合方法; 无机盐诱导融合 高pH-高Ca离子 聚乙二醇(PEG)法 PEG结合高钙-高pH诱导法 电融合技术;(一)无机盐诱导融合: NaNO3法;1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶液在37℃时， 诱发烟草叶肉原生质体融合。;;;PEG法特点：;最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞;(五)电融合技术; 在现代生物学研究中，细胞电融合是单克隆抗体制备、哺乳动物克隆以及抗肿瘤疫苗制备等最新方法中的一个基本步骤。 与通过聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合的化学方法相比，细胞电融合是一种更高效的方法。 Zimmermann教授于1978年创立了细胞电融合的方法。从那以后，他一直致力于进一步发展该技术。 ;1.电融合法原理; 施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。;细胞融合仪 ;A． 聚集通过双向电泳，细胞互相紧密接触 。 B． 融合脉冲采用仅仅15微秒的方波脉冲穿透细胞膜， 细胞膜随后发生融合。 C． 异核体期细胞膜完全融合，细胞质也完全混合。 只有细胞核仍然保持分离状态 D． 完全融合产物现在细胞核也发生了融合。 根据常识，染色体数量下降。;燕麦原生质体的融合;其他方式融合; 神舟四号飞船上进行的太空细胞顺利融合，返回舱里的电融合仪内孕育出首批国产太空生命 。;二十世纪 80 年代末， 细胞电融合技术被用于从胚 胎细胞克隆哺乳动物。 ;三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定;1.互补选择法;2、机械筛选法;异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色 异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色;体细胞杂种植株的鉴定;1、形态学鉴定;2、细胞学观察;3、DNA内切图谱分析;1、细胞杂交产生的新品种或新种应具有 A、多种利用价值的新经济植物， B、将一种植物的抗性（抗病、抗寒等）转入另一植物。 C、使低光合作用效率的植物转变成高光效植物。 D、将豆科植物的共生结瘤固氮能力转入非豆科植物。 E、得到高含量次生代谢产物（生物碱等）的植物。;课后作业;