草地早熟禾赤霉素氧化酶基因PpGA2ox的功能研究.pdfVIP

摘要 摘要 草地早熟禾（Poa pratensis L. ）是一种重要的冷季型草坪草，因其具有良好的坪 观质量而被广泛应用于温带地区。但其生长速度快，需要频繁修剪，从而导致了较高 的养护成本，这一缺点在一定程度上限制了草地早熟禾的推广与应用。培育株型低矮 的草地早熟禾新品种，是草坪草育种的一个重要方向。GA2ox 是赤霉素代谢过程中 的一个关键酶，与植物株型调控密切相关，目前已经从一些植物中获得了 GA2ox 基 因并进行了相关研究，然而草地早熟禾 GA2ox 基因的研究尚未见报道，其功能尚不 清楚。本研究的主要内容是从草地早熟禾中克隆得到了一个 GA2ox 基因及其启动子 序列，通过生物信息学分析、转基因试验、RNA-seq 测序分析以及酵母双杂交等对其 功能进行了系统研究，主要研究结果如下： 1. 利用 RACE 方法从草地早熟禾中克隆得到 PpGA2ox 基因，其开放阅读框为 1047bp，编码348 个氨基酸，基因序列提交至NCBI ，登录号为KX254272 。保守结 构域分析结果表明，PpGA2ox 属于GA2ox 家族。构建系统进化树发现，PpGA2ox 与 TaGA2ox 的亲缘关系最近。PpGA2ox 表达特征分析结果显示，PpGA2ox 在叶片中的 表达量最高，并且在幼嫩叶片中的表达量最高，表明PpGA2ox 主要在活性GA 含量 较高的部位发挥作用。PpGA2ox 表达受外源GA 、MeJA 、IAA 以及干旱胁迫的诱导。 3 亚细胞定位结果显示，PpGA2ox 定位于细胞核和细胞质。 2. 利用染色体步移的方法获得了 PpGA2ox 基因 ATG 上游 1109bp 序列。Plant CARE 在线预测分析发现，该启动子序列中不仅含有TATA-box 、CAAT-box 等基本顺 式作用元件，还包含 10 个MeJA 应答元件，4 个干旱胁迫应答元件，另外还有 1 个 与分生组织表达有关的顺式作用元件。PpGA2ox 启动子序列连接GUS 报告基因转化 拟南芥，转基因植株GUS 染色结果显示，PpGA2ox 在幼苗叶尖和茎尖分生组织以及 成熟植株叶缘凸起位置这种生长比较旺盛的部位活性较高。GUS 基因表达受外源GA3 诱导，而受PAC 抑制。 3. 过表达PpGA2ox 延缓了拟南芥种子发芽，发芽率也有所降低。转基因拟南芥 植株表现出矮化表型，细胞变小，内源活性GAs、ZR 和IAA 含量均显著低于对照。 拟南芥 GA 代谢相关基因的表达量提高。拟南芥矮化的表型可以通过外施 GA3 而得 到恢复。这些都表明PpGA2ox 过表达拟南芥确实降低了内源赤霉素的含量而导致植 株矮化。过表达PpGA2ox 拟南芥花期推迟，抑制开花的基因表达量提高，促进开花 I 摘要 的基因表达量降低。转基因拟南芥叶色加深，叶绿素含量提高。成熟转基因植株矮化 表型依然十分明显，角果明显小于野生型，但是莲座叶片数目较多。PpGA2ox 提高 了酵母菌株的抗旱性，但是抗盐性和对照没有明显差别，表明PpGA2ox 可以在干旱 胁迫中发挥作用。PpGA2ox 过表达拟南芥，从植株生长状态、生理指标测定结果和 抗性基因表达情况可以看出，转基因植株抗旱性提高。这些结果表明PpGA2ox 在干 旱胁迫中发挥重要作用，且抗旱性的提高与转基因植株具有较好的叶片保水力、细胞 膜完整性和渗透调节有关。 4. 对PpGA2ox 过表达拟南芥植株进行RNA-seq 分析，GO 富集分析和KEGG 通 路分析发现，PpGA2ox 过表达对拟南芥赤霉素信号转导通路、光合作用、植株生长 发育和逆境胁迫等方面均具有调节作用。这个结果与PpGA2ox 过表达拟南芥植株矮 化、内源赤霉素和生长素含量降低，叶绿素含量提高以及植株抗旱性提高等表型和生 理指标测定的结果是一致的，进一步表明PpGA2ox 在调控株型和抗逆性等方面行使 重要的