植物总RNAA提取与电泳.pptVIP

实验、七 植物总RNA的提取与电泳  1.实验目的和要求 掌握RNA制备以及常用鉴定方法的原 理、操作步骤、注意事项和技术关键。  2相关基础知识 由于RNA是基因表达过程中非常重要的生 物分子,如mRNA,它携带了DNA的全部编 码信息。RNA的分离是研究基因功能的重 要基础之一,在分子生物学中占有重要 的地位。提取的mRNA可用于 Northern blot、RT-PGR、构建cDNA文库、Gene Chips以及体外翻译等实验。  由于 RNase极稳定,所以,在操作RNA时 要格外仔细,以防RNA被降解。在提取 RNA之前,必须对所用器皿进行 RNase灭 活处理。如用180千烤8小时以上处理玻 璃器皿,或用0.1%的焦碳酸二乙酯DEPc) 的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所 用水以及相关的缓冲液也需要用0.1% DEPC水处理,但Tris-Cl缓冲液等不可以 用DEPC处理  植物细胞内的RNA主要是rRNA(占80~85 %)、tRNA及小分子RNA(占10~15%)和 mRNA(占1~5%)。rRNA含量最丰富,由 25S、18S和5S几类组成。mRNA种类繁多,分 子量从数百至数千碱基不等,但绝大多数 mRNA在3端都有一个 polyA尾巴,因此,可 根据此特性用寡聚脱氧胸苷( OligodT层析柱 从总RNA中将mRNA分离出来。一般情况下, 提取的总RNA也可用于 Northern blot试验。  Source TRNA Size (kb) Mouse 18s 1.9 285 4.7 nan 18s 285 5.0 s. cerevisiae 18S 2.0 26S 3.8 16S 1.5 23S 2.9 Tobacco 16S 5 18S 235 2.9 255 3.7  提取植物RNA时,要注意的问题: 1)一般用机械研磨的方法破碎植物 组织细胞 2)要加入蛋白质变性剂,使核蛋白 与RNA分离并释放出RNA 3)抑制内源和外源 RNase活性 4)将RNA与DNA、蛋白质及其它细 胞成分分开。  已有多种较为成熟的分离总RNA的方法,常 用的有3种 1.苯酚法:用SDS变性蛋白并抑制 RNase活性, 经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素 等后,用NaAC和乙醇沉淀RNA 2.胍盐法:用异硫氰酸胍或盐酸胍和β-巯基乙 醇变性蛋白,并抑制 RNase的活性,经酚氯 仿抽提后再沉淀 氯化锂沉淀法:因为锂在在一定pH下能使 RNA相对特异地沉淀,但容易使小分子RNA损 失,而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。  本实验采用 QIAGEN试剂盒,其原理是依据胍 盐法。即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取 液中裂解植物组织粉末,在提取缓冲液中含有 RNase抑制剂,抑制 RNase活性,保证RNA的 完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留 在柱子上,溶液均质化,包括RNA在内的分子 物质通过离心柱。加入乙醇后,再过第二个离 心柱,RNA就结合在柱子底部有硅胶的膜上 洗去其它杂质,最后用无 RNase的水溶出RNA 该柱子可结合100μg大于200bp的RNA,所以应 控制起始材料的用量。  RNA的检测: RNA的检测主要用琼脂糖凝胶电泳,分为 非变性电泳和变性电泳。一般变性电泳用 的最多是甲醛变性电泳(如 Northern blot实验过程中)