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显微镜 【实验目的】 1） 熟悉显微镜的构造及原理； 2） 学会显微镜的调整和使用、以及测量微小长度的方法 ； 3） 理解数值孔径与显微镜分辨本领的含义，验证显微镜分辨本领与物镜数 值孔径的关系 【仪器用具】 1） 生物显微镜； 2） 测微尺； 3） 测微目镜； 4） 被测物（透射光栅及生物切片）； 5） 2号鉴别率板； 6） 光阑及其支架。 【测量原理】 显微镜是用来观察和研究微小物体的助视仪器。 显微镜已广泛地应用于 现代科学技术和生产和各个领域，没有显微镜的发明和发展，就不可能有现 代科学许多领域的发展。 1）显微镜的基本光路 显微镜的最主要部分是物镜和目镜。 为了简单起见，可以把构造复杂的 物镜和目镜都当作是一单独的薄凸透镜。 其光路见图1。物镜Lo的焦距fo 很短，待观察物体PQ放在它前面距离略大于fo的地方（设物距为So）使PQ 经Lo后成一放大实象PQ（设象距为so）。然后再用目镜Le作为放大镜来观 察这个中间象。中间象PQ应放在目镜 上的第一焦点FE以内（设物距为Se）, 经过目镜后在明视距离 (s =25cm）处成一放大虚象 PQ。因为 Se s (1) 1 1 1 (2) SE SE fE s? SE fo fE (3) 1 So 1 So 1 (4) fo 式中Se代表目镜与显微镜最后成的象 PQ的距离， 代表物镜的第 焦点Fo到目镜的第一焦点Fe的距离，即光学间隔。所以在s、fo、fE、 给定不变的情况下，s°是一个确定的数值，其大小略大于fo,So只有等于这个 数值时我们才能通过目镜在明视距离处看到清晰的象 PQ。从显微镜中能 看到物体的清晰图象时，物镜前表面到被观察物体的距离叫做显微镜的工作 距离，它近似等于So o 为了得到清晰图像而进行的调节sO大小的工作叫调焦。sO增长一点或 减小一点仍然可以看清物体的图象?这个So允许增大及减小的最大范围叫做 焦深（depth of focus）。 2）显微镜的放大本领 物镜的横向放大率为PQPQ目镜的横向放大率为 物镜的横向放大率为 PQ PQ 目镜的横向放大率为E 而显微镜的横向放大率 定义为PQ的长度与物体 PQ长度之比，即 PQ由此可得放大倍数的关系式为 PQ 由此可得放大倍数的关系式为 物镜的横向放大率 O近似地等于物镜和目镜的光学间隔 （忌到FE的 距离）除以物镜的第二焦距，即 fo 由此式可以看出物镜的放大率并不是物镜本身固有的一个特征， 除了与 物镜自身的焦距有关，还与物镜、目镜之间的光学间隔有关。 而目镜的横向放大率可近似为 故显微镜的横向放大率为M 故显微镜的横向放大率为M s 。 fO f E 当PQ成象在明视距离S时，显微镜的视角放大率与横向放大率数值 相等，此时有 (8)—_25 fO f E (8) 3）显微镜的分辨本领 昔通对比度 増强对比度 图2艾里斑 一个点光源经透镜成像后，在普通对比度下，呈现为一个亮点，然而增 强对比度后，会发现物像不是一个点，而是一个衍射花样，中央是明亮的圆 斑，周围有一组较弱的明暗相间的同心环状条纹， 把其中以第一暗环为界限 的中央亮斑称作艾里斑，见图2。艾里斑是以英国皇家天文学家乔治?比德 尔?艾里的名字命名的。因为他在 1835年的论文中第一次给出了这个现象 的理论解释。 两个点光源所成的像将是两个爱里斑。如果这两个点光源（两个物点） 相距很近，而他们形成的衍射圆斑又比较大，以至两个圆斑绝大部分互相重 叠，那就分辨不出是两个物点了。如果一个点光源的衍射图样的中心刚好与 另一个点光源的衍射图样的第一级暗纹相重合， 一般人的眼睛就能刚好分辨 出这是两个光点的像。这时，我们说这两个点光源恰好为这一光学仪器所分 辨。这一恰能分辨的条件称为 瑞利（Reyleigh准则。 图3能够分辨、不能分辨、恰能分辨 3种情况比较 图3所示为光学系统能够分辨，不能分辨和恰能分辨 3种情况的比较。 根据瑞利准则，光学系统的最小分辨角就是艾里斑的角半径。对于直径 为D的物镜，这一角半径可以表示为: (9) 根据显微镜的性能，它的分辨本领不用最小分辨角而用最小分辨距离来 衡量。从（9）式出发，再结合阿贝正弦条件可以导出显微镜的最小分辨距 离: y其中n y 其中n为物方的折射率， 0.61 0.61 n sin NA 为孔径对物点的半张角 (10) nsin 称为显 低NA中NA高Nd 低NA 中NA 高Nd 微镜的数值孔径，用NA表示。并将其具体数值标在显微镜的物镜上。在波 长一定的情况下，数值孔径越大，显微镜的分辨率也就越高。图4所示为低、 中、高三种数值孔径的情况。 NA = n ? (aja = r NA = 0.12 (b)a = 20*NA0.34 (eg 韋 MT NA ? 0.87 图4低、中、高三种数