鸭瘟病毒ELISA抗体检测方法、肝炎病毒1型中和试验、坦布苏病毒抗体血凝抑制试验、ELISA抗体检测方法.pdfVIP

GB/T ××××—×××× 附录A （规范性附录） 鸭瘟病毒ELISA 抗体检测方法 A．1 试剂准备 使用前，将试剂盒中的抗原包被板、样品稀释液、10倍浓缩洗涤液、阳性 血清、阴性血清、单克隆抗体、羊抗鼠酶标抗体、TMB底物溶液和终止液等恢复至室温（20℃～ 25℃）并混匀待用。10倍浓缩洗涤液在使用前用去离子水或蒸馏水稀释10倍。 A．2 样品准备 将待测血清用样品稀释液按1:10稀释后进行测定。 A．3 操作步骤 A．3.1 加样与孵育 取抗原包被板，分别将稀释好的待检血清、阴性和阳性对照血清加入 到抗原包被板孔中，阴性和阳性对照血清各2孔，100µL /孔。轻轻振匀孔中样品，用封板 膜密封包被板，置37℃孵育1小时。 A．3.2 洗涤 去除封板膜，弃去孔中液体，每孔加入300µL洗涤液，作用3分钟，弃去洗 涤液，重复洗涤3次。 A．3.3 与单克隆抗体作用 每孔加入单克隆抗体100µL，用封板膜密封包被板，置37℃孵 育1小时。 A．3.4 洗涤 按3.2中方法洗涤。 A．3.5 与酶标抗体作用 每孔加入羊抗鼠酶标抗体100µL，用封板膜密封包被板，置37℃ 孵育1小时。 A．3.6 洗涤 按3.2中方法洗涤。 A．3.7 显色 每孔中加入TMB底物溶液100µL，轻摇2秒，室温（20℃～25℃）下避光显色 10分钟。 A．3.8 终止 每孔加入终止液50µL，置酶标仪上测定各孔OD450nm值。 A．4 结果判定 A．4.1 结果有效性 当阴性对照孔OD450nm平均值≥0.8，且阳性对照孔的阻断率（PI值） ≥50%，判定检测结果有效。 A．4.2 阻断率的计算 阻断率（PI）用以下公式计算： PI= （1-样品孔平均OD450nm值/阴性对照孔平均OD450nm值）×100% A．4.3 结果判定 当样品的阻断率（PI）≥21.6%，样品判为鸭瘟病毒抗体阳性； 当样品的阻断率（PI）≤15.4%，样品判为鸭瘟病毒抗体阴性； 当15.4＜PI＜21.6%，样品判为可疑；应再重复检测1次，若结果仍为PI＜21.6%，则样品判 为鸭瘟病毒抗体阴性。 5 GB/T ××××—×××× 附录B （规范性附录） 鸭肝炎病毒1 型中和试验 B．1 试剂配制 B.1.1 0.01 mol/L pH 值7.2 的磷酸盐缓冲液（PBS） 甲液 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液 Na HPO 28.4 g 2 4 双蒸水 加至1000 mL 乙液 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液 NaH PO 24.0 g 2 4 双蒸水 加至1000 mL 取甲液72 mL 和乙液28 mL 混合后，用双蒸水稀释20 倍，并按0.85 %加入氯化钠。以 121℃灭菌30 分钟，备用。 B.1.2 生理盐水 NaCl 8.5 g 双蒸水 加至1000 mL.。以121℃灭菌30 分钟，备用。 B．2 血清样本的存放与运送 血清样本置-20 ℃以下冷冻保存，避免反复冻融。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加 冰密封等方式运输。运输时间应尽量缩短。 B．3 操作步骤 B.3.1 样本稀释 用PBS 或灭菌生理盐水将待检血清进行2 倍系列稀释。 B.3.2 病毒稀释 用PBS 或灭菌生理盐水将1 型鸭肝炎病毒稀释成200ELD50/0.2mL 。 B.3.3 中和 取稀释好的病毒液分别与等量系列稀释的血清样本