蛋白诱导ljppt演示文稿.ppt

实验四;实验目的;基因工程的下游技术 基因的诱导表达和重组蛋白的纯化;一、基因表达系统;二、表达瓶颈;三、表达方式;识别标签 β-半乳糖苷酶（lac-Z） 谷胱甘肽-S-转移酶（GST） 多聚组氨酸（poly-his） 人工7肽FLAG;选择表达载体常用的关键元件： 启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。） 融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。如GST融合蛋白用GST柱亲和层析;多聚His标签－6×His，便于镍柱亲和层析纯化。） 分泌信号 筛选标记 其它;四、表达体系选择; 五、实验流程： 细菌 ;六、实验原理;七、本实验表达载体pGEX系统 含有启动子(tac)及Lac操纵基因、SD序列、LacI阻遏蛋白基因等调控序列。SD序列下游就是GST基因，使克隆的外源基因与GST基因相连。表达产物为谷胱苷肽-S-转移酶和外源蛋白的融合体。 优点：①可诱导高效表达；②表达的融合蛋白质纯化方便；③使用凝血酶和Xa因子就可从表达的融合蛋白中切下所需要的蛋白质和多肽。;表达产物: GST-目的蛋白;The structure of lac operon;Repressor and negative regulation;异半乳糖;异丙基硫代半乳糖苷; 本实验采用的pGEX 4T-1表达载体，外源基因与GST形成GST-融合蛋白。由于GST能特异性结合谷胱甘肽，因此在纯化时可利用偶联谷胱甘肽的琼脂糖凝胶进行亲和层析，纯化过程简便且产物纯度高。;八、影响外源蛋白表达的主要因素;九、操作步骤 （一）融合蛋白的诱导表达 1．接种2个单菌落（转化了空质粒pGEX-4T-1的BL21菌种及携带112的菌种）于5ml LB Amp+液体培养基，37℃振荡培养过夜。 2．将500μl过夜培养物与50ml Amp+LB混合，37℃振荡培养4小时。——放大培养 3．将培养物分成8管，每管5ml，按下表所示加入IPTG，30 ℃振荡培养4小时。;序号;4. 每管菌液3000rpm离心5分钟，收集沉淀，弃上清。 5. 每管各加入200 μl 的上样缓冲液，振荡煮沸变性5分钟备用。; 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的 凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 ;优点： (1)凝胶透明，有弹性，机械性能好。 (2)化学性能稳定。 (3)对pH和温度变化较稳定。 (4)几乎无电渗作用，样品分离重复性好。 (5)样品不易扩散，灵敏度可达10-6g。 (6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。 (7)分辨率高。 PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备， 还可测定相对分子质量、等电点等。 ;PAGE原理 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于 缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷 效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。 ;1.浓缩效应 (1)凝胶孔径的不连续性 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 (3)电位梯度的不连续性 2.分子筛效应 3.电荷效应;SDS原理 SDS即十二烷基硫酸钠，是阴离子去污剂，和蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物； SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。;（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1．安装电泳装置 2．配制12% 分离胶10ml： 4 0% Acr/Bis 3.0 ml 1.5 mol/L Tris pH 8.8 2.5 ml H2O 4.3 ml 10% S