AFFYMETRIX基因芯片操作流程大纲纲要.docx

1 AFFYMETRIX 基因芯片操作流程 第一章 真核靶片断制备 <一> RNA 的抽提 一、 哺乳动物细胞或组织 RNA 的抽提 1.总 RNA 使用 QIAGEN ’s RNeasy Total RNA Isolation kit 成功抽提哺乳动物细胞总 RNA. 哺乳动物组织作为 RNA 的来源，建议使用 TRIzol 抽提总 RNA. 2.Poly(A) + mRNA 哺乳动物细胞使用 QIAGEN ’s Oligotex Direct mRNAkit, 从总 RNA 中抽提 mRNA . 哺乳动物组织作为 RNA 的来源，应首先使用 TRIzol 纯化，再进行一个 Poly(A) +mRNA 分 离步骤或使用 kit. 二、 RNA 沉淀 总 RNA 在用 RNeasy Total RNA Isolation kit 分离或洗涤后没有必要沉淀总 RNA. 调整洗脱体 积以制备 cDNA 合成接近希望的 RNA 浓度。 注：为获得足够量的标记 cRNA用来评估和基因芯片表达探针杂交， AFFYMETRIX 建议开 始合成 cDNA 的 Poly(A) + mRNA 最小浓度为 0.02μ g/ μl 时的最小量是 0.2 μ g, 总 RNA 最 小浓度为 0.5μ g/ μ l 时的最小量是 5μ g. 这样有两个好处： （ 1） 有足够量在各步检查样品浓度和质量 （ 2） 制备足够的 cRNA 用于杂交 在 TRIzol 分离和热酚提取后需要乙醇沉淀；见下面方法. 2. Poly(A) + mRNA 大多数 Poly(A) +mRNA 分离过程都会导致得到较稀浓的 RNA ，所以需要在 cDNA 合成前 浓缩 mRNA. 3.沉淀步骤： 1） 加 1/10 体积 3M NaOAc,PH5.2, 和 2.5 倍体积乙醇 . 2） 混匀， -20℃放置最少 1 小时 . 3） 4℃ ,≥12000x g 离心 20 分钟 . 4） 80%乙醇洗涤沉淀 2 次 . 5） 空气干燥沉淀 .继续下面步骤前检查是否干燥 . （ 6） DEPC 处理水重新溶解沉淀 .最合适的溶解体积由 cDNA 合成中需要的 RNA 的浓 度和量来决定 .先阅读 cDNA 合成的过程来决定这一步的适合溶解体积. 4.RNA 测定 用分光光度计分析 RNA 浓度，在 260nm 1 单位吸光度等于 40μg/mlRNA. 需要在 260 和 280nm 测定吸光度来确定样品的浓度和纯度 A260 /A 280 应接近 2.0 为较纯的 RNA( 比值在 1.9-2.1 也可 ) <二>由纯化的总 RNA 合成双链 cDNA AFFYMETRIX 强烈建议 HPLC 纯化 T7-(d7) 24 primer 2 一、 第一链 cDNA 合成 开始 RNA 的量 :高质量 RNA5.0 μ g -40.0μ g 纯化后 RNA 浓缩由 260nm 吸光度决定（ 1 单位吸光度 =40μ g/mlRNA ）， A 260/A 280 应接近 2.0，在 1.8-2.1 的范围内。建议在检测前跑一个琼酯糖电泳测定 RNA 质量。 rRNA 条带应 该比较清晰没有明显的托影。 cDNA 合成前， DEPC 处理水和逆转录的正确体积必须确定。它由加到反应中的 RNA 浓 度和总体积决定。 表 1.1 第一链 cDNA 合成反应逆转录体积 总 RNA （μ g） SuperScript Ⅱ RT( μ l),200U/ μ l 5.0-8.0 1.0 8.1-16.0 2.0 16.1-24.0 3.0 24.1-32.0 4.0 32.1-40.0 5.0 RNA 和 SuperScript Ⅱ RT 体积不要超过 12μ l 合成反应应在 1.5ML 离心管中进行（ RNase-free） 表 1.2第一链 cDNA 合成成分 反应试剂 体积 反应中最后浓度或 量 1:Primer DEPC 水 到反应最后体积 20 Hybridization μ l 70℃放置 10 分钟 T7-(d7) 24 primer 1μ l 100pmol 稍微离心， 放置冰上 RNA 5.0-40μ g 5.0-40μ g 2:温度调节 5× First strand cDNA 4μ l 1× 加到相应管子混合 buffer 均匀 0.1M DTT 2μ l 10mM DTT 42℃放置 2 分钟 10mM dNTP mix 1μ l 500μ M each 3: 第一链合成 SuperScript Ⅱ