第六讲AFLP技术及其在果树学上的应用.docx

第六讲 扩增片段长度多态性 （AFLP ）技术及其在果树学上的应用 （一）AFLP 3 ． 3 技术的发展 引物设 及其原理 计 1 ． 1 3 ． 4 限制性 DNA 内切酶 模板质 1 ． 2 量和浓 模板 度要求 1 ． 3 3 ． 5 引物设 PCR产 计 物检测 1 ． 4 （ 四 ） PCR 反 AFLP 技术 应 在果树上 （二）AFLP 的应用 技术方法及 4 ． 1 其特点 种质资 2 ． 1 源遗传 AFLP 多样性 的方法 及起源 2 ． 2 与进化 AFLP 研究 技术的 4 ． 2 关键 果树品  2 ． 3 种鉴别 AFLP 4 ． 3 的 技术 体细胞 特 点及 无性系 评价 变异的 （三）影响 监测 AFLP 技术 4 ． 4 试验成功的 分子遗 关键因素 传图谱 3 ． 1 的构建 限 制性 4 ． 5 核 酸内 目标基 切 酶的 因的定 选 择和 位和克 组合 隆 3 ． 2 （ 五 ） 接 头设 AFLP 技术存在 计 的问题 1 分子标记发展至今，可以划分为三个阶段， RFLP 是第一代分子标记，该技术以电泳 技术和分子杂交技术为核心， 结果稳定可靠， 重复性好， 适应于建立遗传图谱， 但它对 DNA 检出的灵敏度不高，不适应于目前人们对 DNA 分析精度越来越高的要求；第二代分子标 记是 RAPD ，以电泳技术和 PCR 技术为核心，该技术简便易行，灵敏度高，缺点是结果的 重复性差，稳定性难以保证，在不同实验条件下、设备及操作的情况下得到的实验结果差 异很大； AFLP 是第三代分子标记，是近年来发展起来的很具生命力的分子生物学技术， 本技术结合了 RFLP 和 PCR 技术的特点，具有 RFLP 的稳定性和 PCR 技术的高效性。利 用这一方法， 在不需要预先知道 DNA 序列信息的情况下就可以同时进行多数 DNA 酶切片 的 PCR 扩增。 （一） AFLP 技术的发展及其原理 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism, 扩增片段长度多态性 ) 是 1993 年由荷 兰科学家 M.Zabeau 和 P.Vos 发展起来的一种检测 DNA 多态性的新方法，该技术于 1993 获得欧洲专利局专利（ ZABEAU M ， 1993），其专利权归属荷兰 Keygene 公司。但很快被 人们知道并迅速传播开来， 因此 M.Zabeau 和 P.Vos 不得不正式以论文形式发表出来 （ P.Vos， 1995 ）。 AFLP 的原理是基于对植物基因组总 DNA 双酶切经 PCR 扩增后的限制片段进行选择。 具体是植物基因组 DNA 经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片 段，将特定双链接头 (adapter)连接在这些 DNA 片段的两端，形成一个带接头的特异片段， 作为 DNA 扩增的模板。接头序列以及与其相连的限制位点作为随后进行的限制片段扩增 的引物结合位点。 PCR 引物 3’末端含有选择核苷酸，选择核苷酸延伸到酶切片段区，这样 就只有那些两端序列能与选择核苷酸配对的限制性酶切片段被扩增。扩增片段通过变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳分 离检测。 AFLP 采用 EcoRI 和 MseI 识别序列分别为 6 个碱基 (GAATTC) 和 4 个碱基 (AATT) 。其 人工接头和相应引物设计示意如下 EcoRI adapter 5’——— CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCA TGGTTAA ——————— 5’ Msel adapter 5’————— GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT —————— 5’ 1 CORE ENZ EXT EcoRI primer 5 ’—————— GACTGCGTACC AATTC NNN —— 3’ Msel primer 5 ’—————— GATGAGTCCTGAG TAA NNN —— 3’ 1． 1 限制性内切酶 AFLP 采用稀有切点和多切点限制性内切酶搭配作用，使用多切酶可控制限制性片段 的长度， 而使用稀有切点酶， 则可在一定程度上减少扩增片段的数量。 双酶切产生的 DNA 片段一般小于 500bp，在 AFLP 反应中能够被优先扩增，而且扩增产物能够在凝胶中很好 的分离开来，便于多态性的检出。两种酶同时对基因组 DNA 进行消化，会产生三种限制 性片段。另外， AFLP 采用的两个引物分别与限制性片段的稀有切点末端和多切点酶末端对应，而实际反应中这两种引物中只有一个（通常是稀有切点酶引物）被标记，这样两种 限制性内切酶的结合使用就保证了双链 PCR 产物中只有一条链被标记， 从而避免了组