研究生课---电泳技术及应用-hd.pptVIP

IPG 胶条的平衡 平衡液 6 M 尿素和30% 甘油 减少电内渗 第一步平衡 加DTT 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态 第二步平衡 加碘乙酰胺 使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化 使被分离的蛋白质与SDS完整结合 第二向: SDSSDS 平衡液 50 mM Tris-HCl 6 M 尿素 30% 丙三醇 2% SDS 微量 溴酚蓝 SDS SDSSDS向电泳缓冲液中加 0.5%的琼脂糖 SDS标记纸片 IPG 胶条 SDS 平衡 SDS胶体考马斯亮蓝染色 灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍 可实现PAGE的无背景染色 会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果 胺基黑染色 转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色 转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色 银染 可减少胶内蛋白质产量 对某些种类的蛋白质染色效果差 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响 染色方法 银染色 50% 甲醇 25% 乙酸 4h ddH2O 洗3次 30min/次 0.004% DTT 溶液 30min 0.1% AgNO3 30min ddH2O 30 sec 3% Na2CO3 0.0185% 甲醛 2.3M 柠檬酸 5% 乙酸 25% 甲醇 负染 主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用 能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率 速度快（5~15min）且能保持蛋白质的生物活性 不能用于膜上染色 适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析 胶体扩散染料 主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等 高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质 灵敏度与PAGE胶内的银染类似 不用于胶内染色 染色方法 有机荧光团染料 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧光染料 可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成 灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质 金属螯合染料 与现代蛋白质组学研究相兼容的 专门与常用微量化学表征过程兼容 不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合 染色方法 凝胶的图像处理分析 典型流程 凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立 2-DE 分离的可溶性 E. coli 蛋白 目前双向电泳需解决的问题 样品的制备及溶解 不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白) 难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白) 载样量的提高 初步分离 低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白 定量分析 灵敏度及可重复性 项目 院内 院外 说明 双向电泳 250元/胶 300元/胶 含设备、试剂、分析和辅助材料费,7cm，银染/考染 400元/胶 450元/胶 含设备、试剂、分析和辅助材料费,17cm，银染/考染 500元/胶 550元/胶 含设备、试剂、分析和辅助材料费,24cm，银染/考染 一向等电聚焦 100元/胶 150元/胶 含设备、试剂和辅助材料费,7cm，银染/考染 200元/胶 250元/胶 含设备、试剂和辅助材料费,17cm，银染/考染 300元/胶 350元/胶 含设备、试剂和辅助材料费,24cm，银染/考染 图像结果分析 200元/批 250元/批 双向电泳图（PDQuest软件） 50元/胶 70元/胶 SDS图（Quantity One软件） 双向电泳收费一览表 Thanks! /w_19rt3pbb91.html Southern-DNA, Northern-RNA, Western-Protein * 最佳染色时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同而略有不同。对于含3.5～10％丙烯酰胺的凝胶，染色时间通常介于30min到1h，并随丙烯酰胺含量增加而延长。注意：用泡染法染色时，染料用量较多。单次使用的染色液可重复使用3次左右。 * 在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。 * 【操作方法】 1. 置板：1.5mm洁净玻璃板（厚板和薄板），正确安装在配胶架上，确保两玻璃板平行，板底与海绵条充分接触，防止漏胶； 【操作方法】 2. 凝胶