Bradford法测蛋白质浓度.pptx

Bradford 法测蛋白质浓度 一、实验目的 配制一组浓度分别为 0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ， 0.02mg/ml，0 mg/ml 的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到 蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据 标准曲线得到蛋白质的浓度。 二、实验原理 考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在 游离状态下呈红色，最大光吸收在 488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白 质—色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正 比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在 2min 左右的时 间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下 1h 内保持稳定。该法试 剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比 Lowry 法还高 4 倍，可 测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为 0～1 000μg/ml，是一种常用的 微量蛋白质快速测定方法。 三、实验过程 准备所需的药品和仪器。 计算所需配制的溶液的量。 先配制 1 mg/ml 的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液 （PBS）配制一组浓度分别为 1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ， 0.2mg/ml 的 BSA 溶液，再将这组溶液稀释 10 倍， 得到一组浓度分别为 0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml 的BSA 溶液。计 算第一步稀释各组需要的BSA 溶液及PBS 溶液的体积。;分别为 1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml 的BSA 溶液。 移液枪分别移取 100ul 刚配好的一组 BSA 溶液，置于 1.5ml 的EP 管中，各 加入 900ul 的PBS 溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为 0.10 mg/ml ， 0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml 的 BSA 溶液。另外量取 1ml 的PBS 溶液（BSA 溶液浓度为 0 mg/ml）作对照试验。 用移液枪分别移取 50ul 配好的一组 BSA 溶液，滴加到孔板中，再分别加入 200ul 的考马斯亮蓝（CBB）。静置 10min 后，用酶标仪测得这组 BSA 溶液的吸 光度。 四、实验数据及处理 测得的BSA 溶液的吸光度如下：