BVDV感染MDBK细胞转录组学分析及牛Mx1蛋白对BVDV复制的影响.pdfVIP

摘要 摘 要 牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus ，BVDV ）是一种可感染多种偶蹄动 物的传染性病原，可引起牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease ， BVD/MD ），可造成严重的经济损失。天然免疫在抗病毒感染中发挥重要的作用，其与 病毒间相互作用的分子机制，可以为疫病防控提供新的思路。干扰素（Interferon ，IFN ） 系统是天然免疫的重要组成部分，而干扰素诱导蛋白是干扰素系统的效应分子，发挥直 接抗病毒作用。黏病毒抵抗蛋白 （Myxovirus-resistant protein, Mx ）是IFN 诱导抗病毒状 态的关键成分，对其抗病毒作用机制的研究，有助于对病原与宿主间相互作用的认识。 本文主要从 BVDV 与宿主相互作用的角度，围绕 BVDV 感染牛肾细胞（Madin-Darby bovine kidney cells, MDBK ）前后转录组学变化及牛Mx1 蛋白对BVDV 感染作用的影响 进行了研究，获得了以下结果。 1. 分离鉴定了BVDV BJ-2013 株和BVDV BJ-2016 株2 株病毒 （1）通过RT-PCR 检测、细胞分离培养、间接免疫荧光等方法由牛血清和胎牛血 清中分离、鉴定2 株BVDV 毒株，命名为BVDV BJ-2013 株和BVDV BJ-2016 株。利用 BVDV 5’UTR 序列基因型分型分析，发现BVDV BJ-2013 株和BVDV BJ-2016 株分别属 于1a 和1b 基因型。 （2 ）通过氨基酸序列比对分析和同源性比较分析，发现BVDV BJ-2013 株的NS2 蛋白氨基酸序列中存在12 个氨基酸（LGEGNWLVNADR ）的插入，BVDV BJ-2013 株 与BVDV 08GB44-1 株的核苷酸和氨基酸同源性最高，而BVDV BJ-2016 株与BVDV HJ-1 株的核苷酸和氨基酸同源性最高。通过遗传演化分析，BVDV BJ-2013 株与BVDV 08GB44-1、Oregon 株位于同一分支，亲缘关系较近；BVDV BJ-2016 株与BVDV HJ-1、 PJ 、08GB45-2 等分离毒株被分配于同一进化分支中，显示它们之间的亲缘关系较近。 2. BVDV 感染MDBK 细胞前后转录组学的比较分析 （1）通过转录组学测序技术，比较了BVDV BJ-2016 株感染MDBK 细胞前后不同 时间的细胞转录组的变化。结果显示，共获得转录本53929 条，注释到24616 个基因， 注释到新转录本26651 条、新基因2359 个。 （2 ）通过基因差异表达分析，在Mock vs MBV 2h 、Mock vs MBV 6h 、Mock vs MBV 12h、Mock vs MBV 24h 比较组中分别筛选了1297、1732、3072、1877 个差异表达基因。 通过差异表达基因的GO 富集分析、KEGG pathway 富集分析等，发现BVDV 感染细胞 后引起脂质代谢相关基因的表达上调，表明 BVDV 感染后改变了细胞的代谢网络；发 现BVDV 感染细胞后引起补体和凝血级联反应信号通路中F3 、C3、C1R 等基因表达下 I 西北农林科技大学博士毕业论文 调和部分具有抗病毒作用基因（如ISG15、IFITM1 、Mx1 等）的表达呈现显著变化，提 示补体系统在BVDV 感染过程中发挥重要作用，提示BVDV 感染后对细胞内天然免疫 的抑制有助于其感染形成。 3. 牛Mx1 蛋白对BVDV 的复制具有抑制作用 （1）通过牛Mx1 基因过表达慢病毒和shRNA 干扰慢病毒的感染，分别建立了Mx1 基因稳定过表达和稳定敲低的MDBK 细胞系。鉴定结果显示，牛Mx1 基因稳定过表达 细胞系中Mx1 基因的表达上调5.15 倍，Mx1 基因稳定敲低的细胞系中Mx1 基因的敲低 效率达93.03% 。通过BVDV 分别感染Mx1 基因稳定过表达和稳定敲低的细胞系，检测 BVDV 复制水平，结果显示，牛Mx1 基因的过表达可显著抑制BVDV 复制（P0.01